التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

الربط بديلة (AS) هو عملية شائعة التي تحدث أثناء النضج قبل مرناً. في هذه العملية، يمكن تضمين إكسون متفاوتاً في مرناً ناضجة. وهكذا، من خلال، أحد الجينات يمكن توليد مرناس العديد من التعليمات البرمجية لمنتجات مختلفة من البروتين. ومن المقدر أن 92 – 94% جينات البشرية الخضوع للربط البديل^1،2. نتجت عن بديل طبيعي الربط أنماط الطفرات الوراثية قد ربطت بعدد كبير من الأمراض، بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي وضمور ميوتونيك والسرطان^3،4. وبالتالي من الأهمية بمكان التحقيق، وفهم أفضل لآليات تنظيمية الربط بديلة في محاولة لإيجاد علاجات جديدة للأمراض التي تصيب الإنسان.

كما غالباً ما تنظم بطريقة خاصة بنوع خلية. من المهم تحديد نمط التعبير كجين معين في نظام بيولوجي معين. ومع ذلك، هذا يصبح معقداً عند جهاز معقد يحتوي على العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مثل الدماغ أو القلب، وهو درس. وفي هذه الحالة، هو خياراً مثاليا لنظام تحليل الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين (العش) استخدام أنسجة الفروع حيث يمكن اكتشاف نمط التعبير كجين معين في العديد من أنواع الخلايا في وقت واحد. وفي الواقع، استخدمت تحقيقات خاصة إكسون لتقييم مستويات التعبير إكسون البديلة^5،،من⁶⁷. غير أن هذا النهج ليس مناسبة لتحليل نمط للأسباب التالية. أولاً، التقليدية وأساليب العش عادة استخدام المسابير أطول من 300 شركة بريتيش بتروليوم، بينما متوسط حجم exons الداخلية الفقاريات (إكسون ليس الأول أو الأخير) هو 170 النيوكليوتيدات^8،9. ثانيا، عندما يتم استخدام مجس إكسون على حدة دراسة نمط إكسون بديلة داخلية الربط، isoform مرناً فقط الكشف عنها بواسطة المسبار هو واحد يحتوي على إكسون، بينما isoform مرناً دون إكسون لا يمكن الكشف عنها. وهكذا، معقد لحساب نسبة تقسم في قيمة إكسون البديلة (PSI). وعلاوة على ذلك، يجمع العش الفلورسنت التقليدية غالباً ما العش مع إيمونوستينينج، مما يقلل من كفاءة الكشف ومتانة. على سبيل المثال، في دراسة أن التحقيق الإجهاد الناجم عن الربط isoform التبديل من أستيلكولينستراز (وجع) مرناً، أدمجت في التحقيق العش ديجوكسيجينين والكشف عن استخدام الأجسام المضادة ديجوكسيجينين. وبدلاً من ذلك، تم الكشف عن مسبار المسمى البيوتين المتقارن الفوسفاتيز قلوية/ستريبتافيدين وركيزة الفوسفاتيز القلوية¹⁰. يستخدم الأسلوب لا أي استراتيجية التضخيم لزيادة حساسية الكشف. نتيجة لذلك فإنه يمثل تحديا للكشف عن النصوص مرناً التي يتم التعبير عنها في مستويات منخفضة. وهكذا، يلزم وجود نظام مقايسة ايش أبسط وأكثر قوة لتحليل كتعبير الأنماط في الموقع.

باسيسكوبي مؤخرا قد وضعت استناداً إلى منصة رناسكوبي، راسخة، وتستخدم على نطاق واسع نظام مقايسة العش. كلا النظامين المقايسة تستخدم تقنية تضخيم محددة الهدف الذي يزيد من حساسية الكشف عن^11،12. وما يميز أحدهما من الآخر هو طول التسلسل المستهدفة، وقصيرة بقدر النيوكليوتيدات 50 باسيسكوبي، والنيوكليوتيدات 300 – 1,000 رناسكوبي. وهكذا، من الممكن تصميم المجسات التي تستهدف تقاطعات إكسون-إكسون للكشف عن isoforms مرناً بديلة محددة. في الدراسة الحالية، وتم وضع إجراء لدراسة أنماط التعبير [نيوروفيبرومتوسس] الكتابة 1 (Nf1) إكسون 23 ألف، إكسون بديلة درس على نطاق واسع في نفس المختبر^13،،من^{1415 , 16 , 17}، في أقسام الدماغ الماوس. النتائج تثبت أن باسيسكوبي نظام مثالي لدراسة أنماط التعبير من Nf1 إكسون 23 ألف في الموقع. كما يمكن أن يكون هذا النظام مقايسة تكييفها لتحليل أنماط التعبير من exons بديلة كثيرة، أنه يمثل أداة جديدة قوية في دراسات as.