藤壶Balanus improvisus作为海洋模型的培养和基因表达

1. 在田间收集成人藤壶, 开始新的亲鱼 部署热塑性塑料 (甲基丙烯酸甲酯) 透明板 (110 x 110 x 1.5 毫米3) 在≈ 1–3 m 深度在平静的水域, 以便收集成人藤壶从领域。使用可以采用多个面板 (图 2A) 的帧, 在每个面板和 attachthepanelstotherackusingcableties 的顶部钻取2个孔 (直径为6毫米)。因此, thepanelswillhangverticallyin 水。 当藤壶的沉降 (在面板上被确定为小的白色硬点) 时, 请将面板至少2–3周, 以确保藤壶足够大 (5 毫米), 以便在不被烘干或损坏的情况下转移到实验室。 将这些面板带入实验室, 当它们被固定在improvisus 的 B. 5毫米 indiameter。注意: 成人在田间发展到5毫米的时间高度依赖于食物的供应和温度。通常, 这需要大约3星期在 Tjärnö海洋研究实验室 (58.87 °N, 11.14 °E)。最常见的是, 新的亲鱼面板通常部署在后期琼和收集在8月底。 在将这些面板引入文化设施之前, 请从面板中清除其他有机体。去除其他藤壶物种是最重要的。请注意, 重要的是要经常清洁的面板, 以摆脱污染的物种在耕种期间, 因为这将大大增加生存的机会, 亲鱼。 将面板垂直放置在与研磨槽在聚乙烯托盘 (400 x 400 x 20 毫米3) 的立场上的边缘 (图 2C和2E)。支架上的凹槽为15毫米。 为了准备托盘, 在基座上做一个入口端口, 并在每个托盘的另一侧的顶部出口端口。将每个托盘的入口端口连接到包含约30升水的100升储层, 其入口为20摄氏度, 允许流经ca的速率。每分钟2升。注: 多达8个托盘连接到一个单一的 100 L 水库。 将 100 L 储层连接到温度控制的海水 (20 摄氏度) (例如,由热泵提供的来自传入海水的热量)。注: 藤壶B. improvisus可以生长和繁殖在一个完整的海洋盐度 (30–35);但是, 将盐度降低到ca。25通过将淡水添加到 100 L 水库, 增加了养殖幼虫的产量。 2. 从培养的 Cyprids 开始新世代成人 通过用无毒防水胶带将5个面板组合在一起, 在顶部打开热塑板的立方体。 把立方体放在一个小盘子里 (以防漏水), 然后用海水填满 (25)。保持室温下的水温 (约20 摄氏度)。在立方体顶部添加大约 200 cyprids。 每隔一天喂幼鱼100毫升中肋骨条 marinoi (见步骤 5), 而在立方体。注意: 幼藤可能有困难与摄取卤虫藻(见步骤 3), 因为它们是大的, 因此, 难以吞咽新定居的藤壶。 把水改成一周1x。 2周后, 当面板包含足够的已建立的幼鱼直径至少5毫米, 采取立方体分开, 并移动面板与青少年的托盘与流动 throughseawater, 然后, 饲料的藤壶与一个. 藻幼体。 3.卤虫藻幼体作为成人藤壶饲料的培养 通过使用一个1.5 升塑料瓶, bottomis 切断, 瓶子放在一个立场上颠倒, 并从侧面照亮, 建立一个养殖系统.将瓶颈固定在带有夹具的硅管上, 并将其连接到曝气泵 (图 2D)。 为了孵化鸡蛋, 增加约15毫升的干休眠卵的卤虫到1升 ofseawater。注:卤虫卵孵化成无节幼体幼虫后 24–48 h。为了延迟孵化的幼体 (例如, 在周末), 光线可以关闭, 以减少温度轻微。 要收割卤虫幼体, 关闭曝气, 用铝箔 (或类似的罐头) 使瓶子上部变暗。照亮瓶的下部10分钟孵化的卤虫幼体将游向光。非孵化囊肿将下沉到底部, 囊肿壳将漂浮在表面。 打开底部的夹子。收集中间分数作为一个密集的人口的游泳幼体。注: 每天 (除周末外), 1 l 的密集卤虫幼体悬浮被手动添加到 100 L 水库连接到托盘与成人藤壶。避免任何与空囊壳喂养, 因为他们不提供营养, 主要导致需要更频繁地清洁文化。 4. 藤壶幼虫的收集和饲养 用一只柔软的牙刷, 用淡水轻轻喷洒, 并在必要的时候清除藤壶外壳和面板上的污垢, 用成人藤壶清洁面板。此外, 清洁托盘 (没有藤壶) 和管在热 (75 °c) 淡水。 将一个90µm 浮游生物网的筛子粘在一根切割 PVC 管 (直径16厘米, 高度15厘米) 的一端, 放入一个带有溢出端口的聚乙烯托盘 (30 x 20 x 10 厘米3)。在筛improvisus幼虫在一夜之间收集 (图 2C)。注: 筛网位于藤壶板托盘的出口口下方, 接收出水水并过滤掉幼体。当海水溢出小托盘时, 幼虫留在筛子里。这个小托盘确保筛子永远不会 driedout。 将30升桶放在一个大的水浴中, 温度保持在26摄氏度, 使用鱼缸式鱼缸加热器 (图 2E)。通风和搅拌通过系统空气冒泡保证。 用20升过滤海水 (0.2 µm; 25) 填充桶。添加1升到60/40 混合的2硅藻微藻, S. marinoi和薄的桶 (见步骤 5)。这将给出一个初始密度约 5 x 104硅藻每毫升在桶。注: 藤壶幼体幼虫正趋光。桶是由不透明的白色塑料制成的盖子, 让通过一些光。在冬天, 房间被照亮白天 (8:00–17:00), 但夜间黑暗。在夏天, 外面的光线在白天的大部分时间进入了房间。 将所收集的improvisus幼体转移到结晶皿 (300 毫升; 直径90毫米; 高度50毫米)。 从侧面照亮盘子, 这将吸引幼虫到光源。收集的藤壶幼体, 收集在传入的光与吸管, 并转移到另一个结晶皿。除去剩余的卤虫幼虫。 将B. improvisus幼体幼虫转移到一个烧杯中, 过滤海水的1升。 通过搅拌烧杯轻轻地幼体的数量, 以获得一个甚至悬浮幼虫, 然后从烧杯不同的地方采取五1毫升样品。将每个样品转移到一个微板块中, 以显微镜进行目视检查。计算每五个样本中的幼体数并将它们加起来。 将计数数乘以 200 (1000 mL/5 毫升), 估计在整个烧杯中有多少个幼虫。如果烧杯中有太多的无节幼体幼虫, 稀释样品直至密度最多为1.4万幼虫/l (通常在11,000–12,000 幼虫/l 的范围内)。 添加1升improvisus幼体到一桶, 从而增加大约每桶11,000–12,000 幼虫。注意: 确保不要添加更多的幼体, 因为这会导致食物过少, 从而增加死亡率。 3天后, 收集藤壶幼体90µm 筛。然后清洁桶 (与75°c 淡水), 填补它与过滤海水, 添加新的硅藻饲料 (与开始时相同的数量), 最后添加幼体。Cyprids 6 天后开始出现 (1 天)。 首先收集 cyprids 90 µm 筛 (如上文4.2 所设计)。然后将非蜕皮藤壶幼体和 cyprids 与一个320µm 筛在160µm 筛顶部分开。B. improvisus幼体将收集在320µm 筛和 cyprids 在160µm 筛。注: cyprid 幼虫可以储存在10摄氏度在一个结晶皿在黑暗中, 以供以后使用, 由ca。6天。然而, 贮藏会影响藤壶幼虫的质量和性能, 因此比较不同治疗方法的实验最好是使用相同批次 (和类似贮存时间) 的幼虫, 以避免混淆效果16。 5. 微藻作为藤壶无节幼体幼虫饲料的培养 注: 藻类生长在3种不同类型的文化中: (i) 种群文化, 是长期维持的菌株, 被用于接种的扩大;(二) 开办文化, 这是扩大规模的第一步;最后 (iii) 生产文化, 这是作为藤壶饲料的大量藻类的最终生产规模。 从藻类和原生动物 (CCAP) 的文化收集中订购硅藻种, 用作藤壶无节幼体幼虫的饲料。2种中肋骨条 marinoi (CCAP 菌株 1077/5) 和毛藻单纯形var ( CCAP 菌株 1085/3) 均为饲料提供了良好的效果。 过滤所有海水用于藻类养殖, 使用一个直径为0.2 µm 的墨盒过滤系统. (过滤过的海水也用于孵化一个. 藻卵, 培养藤壶无节幼体幼虫.)对海藻培养的过滤海水进行蒸压 (摄氏105摄氏度, 5 分钟)。 用含无机营养素、微量金属和维生素的 Guillard f/2 溶液丰富的蒸压海水制备微藻培养培养基 (见 Guillard 197517 )。另外, 准备一个溶液硅酸盐 (Na23), 但保持这与 f/2 浓缩分离, 以防止固体沉淀。注: 浓缩液和硅酸盐溶液的浓度可作为每1升海水的1毫升添加。 高压釜用的所有设备在海藻养殖中使用120°c 20 分钟, 蒸压螺钉上限试验管, 1 毫升的 f/2 浓缩和1毫升硅酸盐溶液。当蒸压玻璃器皿和液体冷却到室温时, 加入富集和硅酸盐溶液 theseawater。 在40毫升的螺帽试管中培养微藻。 用大约30毫升丰富的海水填充试管。使用1毫升的2周旧的股票文化, 用一种不育的巴斯德吸管接种培养基。螺丝帽, 然后安装, 但不收紧, 以允许一些气体交换。如果可用, 接种应在层流柜内进行, 以减少污染的风险。注: 股票文化的目的是保持藻类文化的长期基础上, 并作为接种的开始文化。每2周再接种一次股票文化。 将新的股票文化暴露在一盏带有钙强度的白光上。25–50µmole m-2s-1 (以一个浅黑暗的周期 16:8 h)。将旧的股票文化以低光强度作为备份。丢弃任何2周的旧股票文化。 为扩大到藻类的生产文化, 接种的起始文化从股票文化和增长他们在500毫升 Erlenmeyerflasks。 高压釜4锥形烧瓶, 吸管和棉花塞子, 300 毫升过滤 (0.2 µm) 海水, 4 试管与0.3 毫升 f/2 浓缩和4与硅酸盐溶液。冷却 f/2 浓缩和硅酸盐到室温, 并加入锥形瓶的解决方案。用ca给他们接种疫苗。1毫升的2周的老股票文化。注: 用marinoi和2制备2瓶, 用单纯形。 把烧瓶放在震动台上, 光线强度为50µmole m-2s-1。当开始的文化已经获得密集的藻类种群 (黄色棕色的颜色), 他们准备作为接种的生产文化, 将提供藤壶幼虫的食物。 在4升聚碳酸酯瓶中种植生产文化, 硅胶塞子与2个钻孔端口安装玻璃管。 通过装有0.2 µm 空气滤清器的硅胶管将1玻璃管接触到瓶子的底部, 使之成为空气泵。确保第二个玻璃管结束刚好低于硅胶塞子, 并填充棉花, 以允许出口的空气。 每周, 用过滤过的海水填充四4升瓶, 并与塞子一起蒸压。此外, 高压釜4试管与4毫升的 f/2 浓缩和硅酸盐溶液。 冷却后, 加入 f/2 浓缩和硅酸盐溶液的瓶子, 然后接种他们的一半的数量的启动文化在锥形烧瓶。 将四4升瓶放在50–100µmole m-2s-1的光强上。 在ca之后收获生产文化。1周;然后, 它们足够密集, 用于喂养藤壶无节幼体幼虫。注: 生产文化的寿命约为2周, 这意味着在任何时候都有8个活跃的生产瓶。 6. 使用藤壶设计实验研究 将面板与青少年或成人藤壶在控制水族馆, 在那里他们可以种植在 identicalconditions。这称为共同花园实验, 例如, 可以用来了解局部 adaptions 或表型可塑性18, 或研究基因表达的变化与外部因素 (例如, 盐度, 温度, 或 pH 值)。注意: 也可以使用直接从现场收集的面板上的藤壶。使用实验室培养的个体的好处是, 在使用下一代后代时, 可以避免产妇的影响。 将藤壶暴露在 chosentime 间隔内的特定环境条件下, 接着是成年人的收割 (例如基因表达的研究)2。 cyprid 幼虫实验研究基因表达3, 将 cyprids 放在受控水族馆中, 在同一条件下可以培养幼虫。 用筛子过滤 (如步骤4.7 中所述), 在指定的时间段后收割 cyprids, 并根据下面的协议提取 RNA (步骤 8)。 7. 藤壶解剖 清洁实验室空间, 在那里进行解剖和 DNA 取样, bothbefore 和个人之间, 包括所有解剖工具。这是使用氯的长凳 (或96% 乙醇的镊子)。注: 预先制备含有固定介质的标记管 (乙醇或 RNA 稳定液)。 选择大而短期饥饿的个体 (在解剖前2天不要喂养它们)。用牙刷清洁藤壶壳, 以减少其他物种 (如细菌、藻类) 的污染风险, 并用水冲洗。注意: 在解剖之前, 个人短期饥饿的原因是为了避免任何 DNA 污染 (例如, 从肠道中的卤虫囊肿)。 将单独的藤壶放在均匀的表面上, 或者附着在面板上或放在盘子里。从成人身上解剖各自的组织。根据研究的目的, 有几种解剖藤壶的方法。 解剖方法 A: 尽快修复整个藤壶。 使用手术刀将整个藤壶从面板中取出, 将其插入藤壶下并靠近面板表面。注意: 在大多数情况下, 这种操作使基底板几乎完好无损, 从而不影响藤壶内。 小心地通过插入钳在一侧打开外壳 (图 3)。这样做是为了便于侵入外壳内的一个正向介质。注: 如果在将藤壶放置在试管中之前, 壳体未被折断, 则可能导致固定过程较慢, DNA 的质量下降。 把破碎的藤壶放在含有 RNA 储存液或乙醇的试管中。留在溶液中的藤壶至少24小时的固定。当藤壶是固定的, 动物可以取出的固定介质, 并放置在解剖托盘。cirri, 地幔和体细胞 (身体) 可以分开, 并放置在单独的管进一步提取 DNA 或 RNA。注意: 有必要观察是否有受精卵的卵片存在于藤壶内。如果存在, 这些应该被删除之前进行 DNA 提取, 以避免发现多个基因型的样本。 解剖方法 B: 在固定前将藤壶从外壳中除去。注意: 这种方法可能并不总是导致地幔被取样, 因为它是附加到 calcareousshell 的内部。但它可以是一个快速的方法来取样 DNA 的个人。 通过使用解剖钳, 背部和 scutal 板 (图 3), 通过插入背部和 scutal 板之间的钳尖端, 抓住一个盘子, 并轻轻拉动, 以消除它们。 抓住 cirri 与钳和拉藤壶直接出来, 并把它直接放在96% 乙醇或 RNA 稳定溶液固定。注意: 有时, 地幔也会同时被取样, 就像一个薄的上皮与深色色素沉着 (在improvisus)。否则, 地幔可以用手术刀从外壳内部移除, 然后放置在乙醇或 RNA 稳定溶液中。注: 背部和 scutal 板 (如果完好无损) 可以干燥和保存, 因为它们是有用的物种的识别10。如果对物种有任何怀疑, 一般的建议是在初始化解剖之前也拍摄整个藤壶。 8. RNA 提取用于定量 PCR 把成人用于 rna 提取到一个 rna 稳定的解决方案, 孵化他们过夜 (高达24小时) 在4摄氏度, 然后储存在-80 摄氏度。注: Cyprid 幼虫优先干冷冻, 没有 RNA 以后直接地在-80 °c, 通过安置他们在 cryotubes 然后简要地淹没管子 (三十年代) 在液氮之前存放他们在-80 °c。 在 RNA 提取的时候, 解冻在冰上的藤壶和使用它们完整或解剖出要使用的组织 (见步骤 7)。注: 由于个体间的遗传多样性 (≈3–5% 在编码区域的变化;Alm Rosenblad 等, 未发表的数据) poola 成人的数量是可取的, 这将在以后的 qPCR 步骤中最大限度地减少个体间序列变异的影响。 对于 RNAextraction, 添加350µL 的裂解缓冲液, 提供一个 RNA 制备试剂盒到均匀管, 其中含有2.8 毫米的陶瓷珠。注: 与超声波相比, 陶瓷珠提供了更好的 RNA 产量 (代表性结果)。 采取一个成年藤壶 (整个或组织) 或收集至少 20 cyprid 幼虫使用镊子, 并把它们放入均匀管。 与珠磨直接进行破坏和均匀化。 将均匀管与样品和珠子放在珠磨机架上。在二十年代以4.0 米/秒的频率摇动它们. 在冰上冷却样品1分钟。重复2x。 根据商业上可用的 rna 隔离套件的协议准备 rna。注: 应在使用 RNA 提取方法之前进行风险评估 (包括阅读安全数据表), 以确定需要使用油烟机和其他防护衣物 (包括手套) 的危险化学品 (例如,在 RNA 提取过程中加入β-巯基乙醇到裂解缓冲液中, 应在通风罩中进行。 量化 RNA。准备一个工作解决方案, 并添加一个标准和样品, 以200µL 的总容积. 漩涡他们为 2–3 s 和孵化他们2分钟. 将管子插入荧光计并进行读数。 检查 rna 样品的任何蛋白质污染与分光光度计, 并检查他们的 rna 完整性与自动电泳系统 (代表性的结果)。注: 为良好的质量准备, 建议 RNA 的比例为260/280 纳米2–2.2 和 DNA 约1.8。低值表明蛋白质污染, 提取过程必须优化。 9. 基因表达: cDNA 合成和 qPCR 治疗获得的 RNAwith DNase, 以消除任何 remainingDNA 之前, 为 qPCR 的 cDNA。 在制备 cDNA 时, 通过添加 RNA 样本, 而不是逆转录酶来检查是否污染了基因组 DNA。如果在没有逆转录酶的 cDNA 上对所选基因进行 PCR 扩增, RNA 中就存在 DNA 污染。注: 对于用于 rna 序列的样品 (使用下一代测序技术进行 rna 排序), DNase 步骤不那么重要。特别是对于 rna 含量较低的样品, DNase 步骤可能会被省略, 以免在过程中失去太多的 rna。 使用在商业 cDNA 合成试剂盒中指定的范围内的 rna, 在 DNase 处理的 rna 上进行 cDNA 合成, 但通常使用至少 50 ng。 设计 qPCR 底漆, 使它们退火到感兴趣的基因的部分, 其中个体之间的序列标识尽可能高, 但基因 paralogs 之间的序列标识尽可能低。请参见相应的出版物为特定底漆对用于基因表达研究的 Na+/K+ atp 酶3和水通道蛋白2 (图 5)。注意: 为此, 可以使用数以百计的 cyprids 或几个成年人的 RNA 序列数据。 设计用于表达水平正常化的基因的引物 (如肌动蛋白)。成功用于肌动蛋白的引物是, 向前: 5 ‘-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3 ‘, 和反向: 5 ‘-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ‘。注: 肌动蛋白是一种常用的控制基因。然而, 其他一些也被建议作为参考和测试的藤壶19。除了肌动蛋白, 使用 RPL8, 36B4, EF1 和 NADHd1 作为参考已经测试了3。结果表明, 体细胞、cirri、成人或 cyprids 在各自参考基因的表达水平上没有大的差异。 通过将增加的 cDNA (通常在0.25–50的范围内) 添加到含有 SYBR 绿色、dNTP、聚合酶和0.3 µM 每一个正向和反向底漆的混合物中, 优化设计底漆的退火温度。 在不同退火温度下运行 qPCR 协议:95 °c 的初始变性温度为3分钟, 变性步骤为二十年代95摄氏度, 二十年代55–63°c 的退火温度, 三十年代的伸长率为72摄氏度。总共运行40个 PCR 周期。注: 底漆效率应位于90–105% 的范围内, 并计算为 E = (10 ^ (-1/斜率)-1) x 100, 其中斜率是根据其周期阈值 (Ct) 绘制 cDNA 浓度的对数值时获得的曲线斜率。 使用适当数量的 cDNA (通常是 1–10) 执行 qPCR, 采用步骤3中描述的 PCR 协议, 并找到最佳退火温度。注: 较高数量的 cDNA 只用于在极低的数量表达的基因。