أوزة إيمبروفيسوس بالانوس "نموذج البحرية"-استزراع و "التعبير الجيني"
Summary
أوزة إيمبروفيسوس بالانوس (أمفيبالانوس) نموذج لدراسة أوسموريجوليشن والمضادة للحشف على السفن. بيد التفريخ الموسمية الطبيعية غلة عرض لا يمكن التنبؤ بها لليرقات سيبريد. هنا، هو وصف بروتوكول لاستزراع كل سنة-الجولة من إيمبروفيسوس باء ، بما في ذلك إنتاج اليرقات. ويتضح استخدام الإوز المستزرعة في دراسات التعبير الجيني.
Abstract
البرنقيل هي القشريات البحرية مع بالغ لاطئة والعوالق، وتخترق اليرقات. أوزة إيمبروفيسوس بالانوس (أمفيبالانوس) ذات أهمية خاصة كنموذج لدراسة آليات أوسموريجولاتوري بسبب التسامح الشديد للملوحة منخفضة. ويستخدم أيضا على نطاق واسع كنموذج لتسوية الأحياء، ولا سيما فيما يتعلق بالبحوث المضادة للحشف على السفن. ومع ذلك، التفريخ الموسمية الطبيعية غلة عرض لا يمكن التنبؤ بها لليرقات سيبريد للدراسات. يرد على بروتوكول لاستزراع كل سنة-الجولة من إيمبروفيسوس باء- وقد وضعت ووصف مفصل لكل الخطوات في خط الإنتاج (أي، وإنشاء ثقافات الكبار على الألواح، وجمع وتربية أوزة اليرقات، وإدارة الأعلاف للكبار واليرقات). الوصف أيضا إرشاداً بشأن استكشاف الأخطاء وإصلاحها ويناقش المعلمات حرجة (مثلإزالة التلوث، وإنتاج الأعلاف عالية الجودة، والقوى العاملة اللازمة وأهمية جودة مياه البحر). كل دفعة من النظام بتثقيف أقصى غلة النوبليوس 12,000 تقريبا، ويمكن تقديم أربع دفعات في غضون أسبوع، حيث يمكن أن تنتج ما يصل إلى اليرقات 50,000 تقريبا كل أسبوع. الطريقة المستخدمة للثقافة إيمبروفيسوس باء- ، على الأرجح، إلى حد كبير، كما ينطبق على غيرها من اللافقريات البحرية مع سويمينجلارفاي مجاناً. يتم عرض البروتوكولات لتشريح الأنسجة المختلفة من البالغين، فضلا عن إنتاج الحمض النووي الريبي عالية الجودة للدراسات المتعلقة بالتعبير الجيني. وهو أيضا وصف الكبار كيف مثقف وتربية سيبريدس يمكن أن تستخدم في طائفة واسعة من النماذج التجريبية لدراسة التعبير الجيني فيما يتعلق بالعوامل الخارجية. ويتضح استخدام الإوز المستزرعة في التعبير الجيني مع دراسات الأدوار الممكنة أوسموريجولاتوري نا+/K+ أتباسي وأقوابورينس.
Introduction
البرنقيل هي القشريات البحرية مع بالغ لاطئة والعوالق، وتخترق اليرقات. معظم الأنواع 1,200 من الإوز تعيش في المياه الضحلة وكثير كثيرا ما يتعرض للملوحة منخفضة. أحد الأنواع، أوزة خليج يرتجل بالانوس (أمفيبالانوس) (إيمبروفيسوس)، يمكن أن يتسامح مع ما يقرب من المياه العذبة، وتشارلز داروين ووصف هذا النوع من تيار صغير في مصب نهر ريو دي لابلاتا في أوروغواي1. يجعل التسامح الشديد الملوحة تولو إيمبروفيسوس باء- نموذج ذات أهمية خاصة لدراسة آليات أوسموريجولاتوري2،3. هذا أوزة تفضل ظروف الملوحة ولكن قادر على العيش في المياه مع الملوحة من حوالي 1.6 الأمير سلطان ليصل إلى 40 جامعة الأمير سلطان4. فمن الأنواع أوزة الوحيدة الموجودة في بحر البلطيق الملوحة. ويعتقد أن تنشأ من الساحل الشرقي للقارة الأمريكية إيمبروفيسوس باء- لكن اليوم وجدت في جميع أنحاء العالم بسبب تشتت الشحن5. هو كائن قاذورات رئيسية ويوجد عادة في الصخور، والأرصفة، وبدن السفينة، وذلك للمصلحة العامة لفهم آليات الآخذين في الإنشاءات في المياه البحرية والمائلة للملوحة6،7.
على غرار معظم الإوز الأخرى، إيمبروفيسوس باء- هيرمافروديتيك مع تبادل الخبرات؛ يحدث التكاثر عن طريق التزاوج بين الأفراد المجاورة استخدام القضيب ممدود والإخصاب داخلي. فترة الإنجاب أساسا من أيار/مايو إلى أيلول/سبتمبر. وقد إيمبروفيسوس سبع مراحل اليرقات البحرية (ستة النوبليوس تليها مرحلة سيبريد واحدة8). البوابات البويضة المخصبة إلى يرقة ناوبليوس التي تخترق ويغذي في عمود الماء لتصل إلى عدة أسابيع قبل الصوف إلى يرقة سيبريد غير تغذية. يستخدم إشارات متعددة إلى العثور على موقع مناسب لتسوية سيبريد ويخضع ثم تحول إلى أوزة الأحداث لاطئة9. الأنواع التي يمكن أن تكون مثقف في المختبر وعمر 1 – 2 سنة في البحر (2 – 3 سنوات في مختبر الثقافة). في المتوسط، إيمبروفيسوس باء- ينمو إلى 10 ملم في القطر (بحد أقصى يبلغ حوالي 20 ملم)، ويصل إلى أقصى ارتفاع حوالي 6 مم (على الرغم من أنه يمكن أن يزداد طولاً في ظروف مزدحمة). يمكن أن تكون الأنواع التي حددتها شل حتى كلسية السلس (أبيض أو رمادي)، قاعدة كلسية منقوشة إشعاعيا لصفيحة شل، والشكل1،لوحات تيرجال10.
أوزة إيمبروفيسوس باء- لديها العديد من الميزات مفيدة كنموذج للدراسات أوسموريجوليشن، مع تركيز على الآليات الجزيئية والفيزيولوجية وكذلك التفاعلات الإيكولوجية وعواقب التطوري. فإنه يستخدم أيضا على نطاق واسع كنموذج للتحقيقات المتعلقة بتسوية الأحياء، ولا سيما فيما يتعلق بالبحوث المضادة للحشف على السفن والآليات المشاركة7،11،،من1213. ومع ذلك، التفريخ الموسمية الطبيعية غلة عرض لا يمكن التنبؤ بها لليرقات سيبريد للدراسات. القدرة على ثقافة هذه أوزة من خلال دورة حياته كلها على مدار السنة ولذا، موردا رئيسيا لتمكين أنواع مختلفة من الدراسات الجزيئية والميكانيكية. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح وجودها في المياه البحرية/المالحة في العالم للجمع بين الميدانية والدراسات التجريبية. الإكثار يمكن أن تنتج أيضا أسر النسب المعروفة ل تثقيف طويلة الأجل14، ووقت جيل لبضعة أشهر قد يسمح تطور تجريبية على المدى الطويل. تتوفر أيضا مشروع جينوم والعديد من ترانسكريبتوميس، وقد استخدمت هذه الموارد لاستنساخ عدة جينات (مثلاً، الجينات ذات أهمية في أوسموريجوليشن)2،3.
والهدف من هذا البروتوكول لوصف كيفية إنشاء والحفاظ على ثقافة أوزة إيمبروفيسوس باء- طوال السنة من أجل إجراء دراسات التعبير الجيني على البالغين أو يرقات لهذا الكائن. ريتشوف et al. 15 وصف موجز لطريقة لاستزراع الإوز من الإفراج عن الوظيفة إلى تسوية سيبريدس للأنواع Balanus amphitrite. البروتوكول قد تم تكييفه لاستزراع كل سنة-الجولة من إيمبروفيسوس باء في Tjärnö مختبر الأبحاث البحرية (السويد)، ويرد وصف مفصل لكل الخطوات في خط الإنتاج، بما في ذلك الإنتاج وتربية أوزة اليرقات، فضلا عن إدارة الأعلاف للكبار واليرقات. لمحة عامة للإجراء الكامل، انظر الشكل 1. استخدام نظام تثقيف هو مثال مع بعض الهياكل التجريبية المشتركة ويتضح في دراسات الجينوم الوظيفي نا+/K+ ATPase وأكوابورينس، توضيح وظائفها الممكنة في، أوسموريجوليشن2 3. من الضروري في بعض الأحيان لدراسة التعبير الجيني في أنسجة محددة، وسيتم تغطية بعض أساسيات التشريح أوزة. بإمدادات جيدة من مياه عالية الجودة، استزراع أوزة إيمبروفيسوس باء، ويحتمل أن تكون العديد من الأنواع الأخرى، ينبغي أن يكون من الممكن في مختبرات البحرية في جميع أنحاء العالم.
Protocol
Representative Results
Discussion
ثقافة أوزة في Tjärnö مختبر الأبحاث البحرية (السويد) وقد تم تشغيل أكثر من 20 عاماً، وقد استخدمت للدراسات التي أجريت في العديد من المجالات البحثية المختلفة. تم نشر ما يزيد على 30 ورقة علمية التي استخدمت نظام تثقيف خلال السنوات الماضية، بما في ذلك دراسات في13،المضادة للحشف على السفن22، الهيدروناميكا23، الإيكولوجيا الكيميائية24، وتغير المناخ16 ، علم الأحياء التطوري5، والبيولوجيا الجزيئية2.
تجنب اختيار بعض الأفراد التي أكثر تكيفاً مع البيئة مختبر (الأفراد التي قد لا تكون ممثلة للسكان البرية)، يوصي بجمع من أمهات جديدة من الميدان كل سنة. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها ممارسة جيدة لتجديد الثقافة سنوياً، حيث يوجد حوالي 50-80% وفيات لدى البالغين خلال سنة عادية. ومع ذلك، إذا كان الهدف هو إنتاج خطوط الفطرية أو لإعداد الدراسات المتعلقة بتطور تجريبية، الأسر التي تمت تربيتها في المختبر فقط لاستخدامها.
وقتاً طيبا لجمع إيمبروفيسوس على لوحات في مختبر الأبحاث البحرية في Tjärnö في حزيران/يونيه – آب/أغسطس لأنه في ذلك الوقت، هناك إمدادات جيدة من اليرقات سيبريد في البحر. تحقق من الأفرقة أسبوعيا معرفة متى يبدأ تسوية أوزة ويدويًا إزالة الآخر استقر الأنواع من إيمبروفيسوس باء (مثلبلح البحر، تونيكاتيس، بريوزوانس، وانيمونات، نيميرتينس/اﻷنبوبية وغيرها من الأنواع أوزة) من لوحات (مثلاً، مع فرشاة أسنان). حول Tjärnö، هناك ثلاثة أنواع المياه الضحلة أوزة الحالية (باء-إيمبروفيسوس، بالانويديس سيميبالانوس، و كريناتوس بالانوس). ومع ذلك، هو إيمبروفيسوس باء- المهيمنة فولر من الأسطح الملساء الصلبة خلال تموز/يوليه – آب/أغسطس. س. بالانويديس في فترة التسوية خلال أوائل الربيع ويفضل أساسا الطبيعية ركائز (مثلاً، الحجارة). باء-كريناتوس يمكن أن تحدث في الأرقام منخفضة على اللوحات خلال فصل الصيف.
من الممكن أيضا أن تبدأ أوزة الكبار الأجيال الجديدة من المثقفين سيبريدس، الذي سيكون ضروريا إذا تم إنشاء بعض ليناجيس بسمات محددة، أو في الدراسات المتعلقة بتطور تجريبية. الطريقة الأكثر ملاءمة لبدء الأجيال الجديدة من البالغين لتسوية سيبريدس على الألواح الحرارية في المختبر. يمكن استخدام هذه اللوحات مع سيبريدس حديثا تمت تسويتها أيضا في علاجات تجريبية أو للتعرض في الميدان. في الحالات الطارئة، واحدة أيضا استخدام البالغين على الصخور من موقع قريب (مثلاً، إيديفجوردين في حالة مختبر الأبحاث البحرية Tjärnö) التي يشيع فيها إيمبروفيسوس (ب) . هؤلاء الكبار المنشأة بالفعل تعامل بنفس الطريقة كالكبار على الألواح، ومن ثم يتم وضعها في علب وتتغذى عن طريق التدفق عبر النظام. يمكن أيضا استخدام تدفق الخلايا ﻹنشاء أفرقة مع الإوز25. هذه هي الدوائر من خلال تدفق مع العوالق الصافي على الجانبين التي سيبريدس عدم تسوية، مع لوحات كسطح المستوطنة الوحيدة لليرقات.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لإقامة ثقافة أوزة أداء الطويل الأجل بما في ذلك جميع مراحل الحياة. الطرق المستخدمة للثقافة إيمبروفيسوس باء- على الأرجح، إلى حد كبير، كما ينطبق على غيرها من اللافقريات البحرية مع تخترق، بلانكتوتروفيك اليرقات. وصف الإجراءات تثقيف لبعض الأنواع بالفعل جيدا (مثلاً، لأنواع مختلفة من المحار وبلح البحر الأزرق)26، بينما بالنسبة لغيرها من اللافقريات البحرية، وهناك فقط بضعة أمثلة من الثقافات طويلة الأجل تمتد حياتهم كلها دورة. واحدة من أولى محاولات ناجحة للثقافة الإوز (amphitrite باء) فعل ريتشوف et al. 15-ينبغي أن تكون الموارد المالية والشخصية الطويلة الأمد في المكان قبل النظر في إعداد أوزة استزراع مرفق. الحفاظ على هذا النوع من السنة–حول أوزة يتطلب ثقافة شخص واحد على الأقل العمل نصف الوقت. قد يكون هناك بعض الإمكانات لأتمتة بعض الخطوات في خط الإنتاج، أساسا استزراع الطحالب المجهرية27مستقبلا. وباﻹضافة إلى ذلك، ولكي تنجح، من الضروري للوصول إلى كميات كبيرة من مياه عالية الجودة. استزراع الطحالب المجهرية، الارتيميا، والإوز لا تنطوي على أي إجراءات السلامة الخاصة. ومع ذلك، قد تحتاج إلى اختبارات لبعض المواد المضادة للحشف على السفن أو المواد الكيميائية السامة احتياطات خاصة.
تم فحص اللوحات عدة مرات في أسبوع للتلوث. تم ضخ ما يصل من عمق 40 مترا في “المضيق كوستر” خارج مختبر الأبحاث البحرية في Tjärnö مياه البحر المستخدمة في الثقافة وتم تمرير من خلال اثنين من المرشحات الرملية قبل إدخال نظام المياه في المختبر. إذا جرى لا تصفية المياه، سيكون هناك أكثر بكثير من التلوث في الثقافة. من الضروري تنظيف بانتظام على لوحات في الثقافة من البقايا واللافقاريات الأخرى (مثلاً، بناء رئد وانيمونات ونيميرتينس المفترسة) الذي أدخل النظام عن طريق الإمداد بمياه البحر من الميدان. على سبيل المثال، إذا كان يتم إنتاج لا اليرقات على الرغم من حقيقة أن الثقافة كان جيدا تغذية وخلاف ذلك يبدو أن تكون في حالة جيدة، قد تكون المشكلة وجود نيميرتينس التي يبدو أنها تمنع التزاوج. وبطبيعة الحال، العديد من الكائنات الحية ملوثة في الثقافة في مختبر الأبحاث البحرية Tjärnö كانت محددة للساحل الغربي السويدي، وأنواع أخرى من تلوث الكائنات الحية سوف تكون سائدة وتكون أكثر من تحد في المناطق الجغرافية الأخرى. على الساحل الغربي للسويد، غير عادية البحث عن التلوث بالأنواع الأخرى أوزة على الألواح. في بعض الأحيان، تم العثور على إنشاء بالانويديس س. ، ولكن هذه مشكلة هامشية جداً (على الأكثر، واحد س. بالانويديس الملوث لعينات إيمبروفيسوس باء- 10,000). وكان عدم تلويث الأنواع يعتمد على الأرجح على النظام لإنشاء ثقافات جديدة خلال فصل الصيف، عندما كانت لارفايفروم إيمبروفيسوس باء- الغاية المهيمنة. وبالإضافة إلى ذلك، هناك أيضا إثراء إيمبروفيسوس باء- واضحة على الألواح منذ هذه الأنواع انتقائية للأسطح الملساء13.
من الضروري إزالة الإوز الميت الكبار. إذا تركت هذه القذائف الفارغة على الألواح، يمكن أن تصبح مأوى الارتيميا النوبليوس وكذلك لمختلف الأنواع ملوثة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد لوحظ أن الأفراد الميت تؤثر على رفاه المجاورة الأفراد، ربما مع الإفراج عن المركبات السامة أثناء التحلل. وثمة نتيجة إضافية لوفيات البالغين أن بعض الأفراد سوف تترك وحدها وبعيدا جداً من غيرهم من الكبار للسماح بالتزاوج (على الرغم من أن الإوز يكون القضيب أطول في عالم الحيوان بالنسبة لحجمها)28. هؤلاء الأفراد سوف البقاء على قيد الحياة ولكن غير منتجة لليرقات. بيد أن هؤلاء الأفراد البالغين الانفرادي يمكن إزالتها بلطف دون الأضرار بالقاعدة اللوحة ويوضع أفقياً قريبة من الآخرين لتمكين التزاوج. يمكن أيضا أن يكون تزاوج بوضع لوحات مع شخص بالغ واحد على كل الإوز لكن إغلاق ما يكفي بحيث يمكن أن يحدث تلاقح. وبهذه الطريقة، يمكن أن تكون خطوط الوراثية المنتجة14.
من الأهمية بمكان لإنتاج أعلاف عالية الجودة وتغذية الثقافات تقريبا كل يوم. يمكن أن يؤدي إصدار متناقصة من اليرقات حتى بضعة أيام دون طعام. وأظهرت الاختبارات السابقة لتكوين نظام غذائي أن الدياتومات ضروريان للنمو والبقاء على قيد الحياة من النوبليوس أوزة. العديد من الأنواع دياتوم تبدو كافية كتغذية، على الرغم من أن خلايا صغيرة أو الانفرادي (أقل من 10 ميكرون في القطر) قد يكون من الضروري لابتلاع الوظيفة. الأنواع S. مارينويو البسيط C. بسيودونانا ت. كافة أثبتت أن تكون تغذية كافية للوظيفة إيمبروفيسوس باء ، وكذلك سهل لزراعة. وبالإضافة إلى ذلك، جودة الأعلاف أعلى عموما لاطراد نمو الطحالب. وأفيد أيضا أن الدياتومات تعتبر أساسية لإنشاء الثقافات المنتجة amphitrite ب15. نظرية لأهمية الدياتومات هو أن لديهم ملف تعريف فريد من الأحماض الدهنية وخاصة غنية ب الأحماض الدهنية غير المشبعة عالية 20:529. قد ثبت أن بعض الأحماض الدهنية هامة للتنمية الناجحة للمحار يرقات30.
على مر السنوات، كانت هناك لا حالات الأمراض الضارة في ثقافة أوزة. في aquacultures اللافقارية تجارية كثيرة، مثل المحار وبلح البحر، أمراض شائعة بل وقد تكون ضارة جداً. كما أبلغ عن الآثار الضارة للفيروسات من السكان البرية. حلت محلها المحار أصلي في فرنسا المحار البرتغالي Crassostrea angulata في عام 1925، ولكن هذه الأنواع كانت تمحى من قبل إيريدوفيروس حول عام 197031. في الآونة الأخيرة، كانت هناك أحداث وفيات هائلة في محار المحيط الهادي Crassostrea gigas في الثقافات في جميع أنحاء العالم، التي يبدو أن تترافق مع هربس 1 أستريد32. وقد نشرت حتى الآن لا تقارير بشأن مسببات الأمراض، والبكتيريا، أو الفيروسات على الإوز. ومع ذلك، في مشروع الجينوم الجارية على إيمبروفيسوس باء، عثر على تسلسلات فيروس (Alm روسينبلاد et al., بيانات غير منشورة) ولكن مع أي صلة واضحة بأعراض الأمراض. طبقت سابقا خليط من المضادات الحيوية للثقافات للتقليل من خطر الإصابة بالالتهابات البكتيرية؛ ومع ذلك، يتم حاليا التخلي عن هذا الإجراء وحتى الآن، وهذا لم يسبب أي مشاكل التلوث.
إذا كان يتم تسخين مياه البحر (كما هو موضح أعلاه)، الانهاك قد يكون أشد خطر في خط إنتاج الثقافة. وبطبيعة الحال، من الصعب حماية ضد ارتفاع درجة الحرارة، على الرغم من أن أجهزة الاستشعار ونظم مناسبة للتنبيه قد يكون المستخدمة (مثلإرسال رسائل البريد الإلكتروني أو النص إلى الأشخاص المسؤولين). حوادث من هذا النوع في الماضي قد أسفر عن مقتل كبير من الكبار في الثقافة. هذا، بطبيعة الحال، تكون مدمرة والخراب استثمارات طويلة الأجل في الوقت والمال. على وجه الخصوص، ستكون هذه كارثة إذا أنشئت خطوط الوراثية الفطرية. لضمان طول العمر لهذه الخطوط، وأمن لهم من الفقدان بطريق الخطأ، سيكون من المستصوب وضع منهجية نعد للاوز. وأفيد أن اليرقات من محار المحيط الهادي يمكن تجميدها لأسفل وإحياء مع نجاح جزئي33. وكان كريوبانكينج أيضا أداة قيمة للحفاظ على الموارد الجينية في طائفة واسعة من الأنواع34. الوظيفة حتى من amphitrite باء البقاء على قيد الحياة تجميد35، ووجد أن 20% الأفراد مجمدة إلى أسفل مغيرة بنجاح إلى سيبريدس36. ولكن تطبيق تجميد الاستدامة طويلة الأجل للثقافات وحتى الآن لم يعتمد، بل هذا الفعل اللازم للحفاظ على البنود التي تم تحديدها؛ وهذا سيكون خطوة أساسية لترسيخ إيمبروفيسوس في موديلسيستيم البحرية قوية.
هنا، قدم بروتوكول لتشريح الأنسجة المختلفة من الكبار من إيمبروفيسوس باء (أي، سيري، سوما، ورف). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضا استخراج الأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، الأنسجة اللينة بين عباءة الأنواع الغشائي قاعدة فورموزي يم تيتراكليتا الخارجية والداخلية تم بعناية معزولة واستخدامه لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليل الحمض النووي الريبي seq ل التعبير الجيني37. وينص البروتوكول الاستخراج المحسن المبين الموصوفة هنا كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة للتسلسل من الحد أدنى من ابتداء من المواد. أولاً، جمع اليرقات فردية مباشرة في أنابيب التجانس يقلل أي خسارة أثناء النقل من أنبوب واحد إلى آخر. وعلاوة على ذلك، بين أساليب مختلفة اختبار، التجانس مع حبات السيراميك ثبت أن تسفر عن الأكثر كفاءة من حيث الجيش الملكي النيبالي والنزاهة، مقارنة بتجانس sonication أو مدقة. عند التخطيط للتعبير الجيني أو تجارب علم الجينوم، يتعين على المرء أن نأخذ في الاعتبار التحدي المتمثل في عالية التباين الوراثي في الإوز، على الأقل إيمبروفيسوس (ب). وقد أوزة تنوع الوراثي في النطاق 3 – 5%، حتى في ترميز المناطق (Alm روسينبلاد et al., بيانات غير منشورة). وهذا، بطبيعة الحال، يضع مطالب محددة على تصميم كبسولة تفجير لتحليل قبكر، حيث أكثر حفظت مناطق ينبغي تحديدها واستخدامها كقوالب للإشعال من أجل الحصول على بيتوينباتشيس نتائج التعبير متسقا. المناطق المصانة للجينات المستهدفة، مثل أكوابورينس و Na +/K + ATPases، يمكن التعرف عن طريق دراسة مدى تغير تسلسل هذه الجينات في تسلسل الحمض النووي الريبي البيانات المتحصل عليها من سكان سيبريدس التي تحتوي على مئات أفراد. تحليل جينوم، سيتم أخذ عينات الحمض النووي. ومع ذلك، الحصول على الحمض النووي عالي الجودة من إيمبروفيسوس (ب) يمكن أن يكون تحديا21.
وفي الختام، أثبت ثقافة أوزة أنشئت لتكون أداة فعالة في أنواع مختلفة من الدراسات التجريبية. على وجه الخصوص، كل سنة حول إنتاج اليرقات يسمح لنا بإجراء تجارب دون أن تقتصر على فترة التفريخ طبيعيا ( إيمبروفيسوس باء، هذا خلال فصل الصيف). يمكن استخدام اليرقات التي تم الحصول عليها لتنفيذ مجموعة واسعة من الدراسات التجريبية، بما في ذلك فحوصات التسوية، فحوصات السلوك، ودراسات التعبير عن جينات محددة، فضلا عن دراسات على نطاق الجينوم الترنسكربيتوم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث منحة عام 2017-04559 من مجلس البحوث السويدية (VR) ومشروع الاتحاد الأوروبي دعم الواجهة البحرية إلى بلومبرغ أندرس. على وجه الخصوص، إنشاء مرفق تثقيف، على مر السنوات، حظي بدعم من المنح لكل جونسون R. من وكالات التمويل التالية: صندوق الضمان الاجتماعي (المؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية) من خلال برنامج “العلوم البحرية” والتكنولوجيا و MISTRA من خلال برنامج “الرسام البحرية”. برنتسون كينت بدور فعال في المراحل الأولى من إعداد كولتورينجفاسيليتي. مزيد من التمويل لإنشاء مرفق تثقيف قد تأتي من المركز “علم الأحياء التطوري البحرية” (www.cemeb.science.gu.se)، وهو يؤيد بمنحه لينيوس من FORMAS مجالس الأبحاث السويدية والواقع الافتراضي.
Materials
| Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels | Plastic produkter, Bromma, Sweden | transparent glas | |
| 1.5-L PET bottle | |||
| Artemia | INVE Aquaculture, Belgium | We have tested different companies; this is really the best one | |
| Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1077/5 | |
| Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1085/3 | |
| Millipore cartridge filter system | Millipore | ||
| cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm | Millipore | cartridge CWSS01S03 | High capacity for large volumes |
| polycarbonate bottle | Nalgene | autoclavable | |
| RNA later | Qiagen | 76106 | Fixation solution to preserve RNA |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen/Thermofisher Scientific | AM1907 | DNAse kit to remove DNA from prepared RNA |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708890 | cDNA synthesis kit |
| SYBR Green supermix | Biorad | 1708880 | Dye for QPCR |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | RNA extraction of adults or many cyprids |
| Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes | Precellys | KT03961-1-003.2 | Ceramic beads for homogenisation |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | RNA extraction of few cyprids |
References
- Darwin, C. . A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , (1854).
- Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
- Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
- Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
- Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
- Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
- Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
- Anderson, D. T. . Barnacles – structure, function, development and evolution. , (1994).
- Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
- Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
- Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
- Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
- Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
- Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
- Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. , 22-60 (1975).
- Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
- Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
- Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
- Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
- Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
- Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
- Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
- Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
- Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
- Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
- Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
- Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -. &. #. 1. 9. 7. ;. Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
- Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l’Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
- Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
- Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
- Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
- Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
- Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
- Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).
