海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

1. 新しい親フィールド大人ふじつぼ類のコレクション フィールドから大人のフジツボを収集するために熱可塑性樹脂 (ポリ メチルメタクリ レート) 透明パネル (1.5 mm3x 110 x 110) ≈ 1-3 メートルの深さで穏やかな海を展開します。いくつかのパネル (図 2A) を取ることができる使用するフレームは、各パネルと attachthepanelstotherackusingcableties の上部の角 (直径 6 mm) と 2 の穴をあけます。したがって、thepanelswillhangverticallyin 水。 フジツボの決済は (パネル上に小さな白いハード点として識別された) が発生したとき、フジツボが大きいかどうかを確認する最低 2-3 週間はパネルのまま乾燥または破損して得ることがなく研究室に転送するのに十分な (5 mm)。 彼らはカリフォルニア州のサイズに達している定住B. improvisusで覆われているときは、研究室にパネルをもたらします。5 mm 試料。注: 5 mm のフィールドを開発する大人のための時間は食べ物や温度の可用性に大きく依存。通常、これは Tjärnö 海洋研究所で約 3 週間をかかります (58.87 ° N, 11.14 ° E)。最も一般的に、新しい親のためのパネルは一般的に 6 月下旬に展開し、8 月の終わりに収集します。 導入する前に、文化施設にパネルは、パネルから他の生物をクリーンアップします。最も他のフジツボの種を削除することが重要です。大幅、親魚の生存の可能性は増えますので、栽培中に種を汚染をなくすパネル頻繁にきれいにすることが重要であることに注意してください。 ポリエチレン トレイ (20 mm3x 400 x 400) に精白溝をスタンドの端にパネルを垂直方向に配置 (数字の 2と2 e)。スタンドの溝は 15 mm 離れています。 トレイを準備するために各トレイの反対側、基地入口ポートと上部の出口ポートを作る。各トレイの入り口ポートを含む約 30 リットルの水 20 ° C で外洋の海水の入口とcaの割合でフローを許可するように 100 L タンクに接続します。毎分 2 L。注: 8 トレイまで、単一の 100 L タンクに接続されました。 100 L タンクを低温海水 (20 ° C) (例えば、着信の海水から熱交換を行う熱ポンプによって提供される) に接続します。注: フジツボB. improvisusを育て、完全海洋塩分 (30-35 psu); で再現ただし、 caに塩分を減らすこと。100 L タンクへ淡水を追加して 25 psu 文化から幼虫の出力が増加します。 2. 培養 Cyprids から大人の新世代を開始 一緒に非毒性で耐水性のテープを用いたテーピング 5 パネルの熱可塑性樹脂パネル上部に開いてのキューブを構築します。 (漏) 小さなトレイにキューブを配置し、海水 (25 psu) でそれを埋めます。室温で水を保つ (ca。 20 の ° C)。キューブの上部に約 200 cyprids を追加します。 Skeletonema marinoi 100 mL で一日おき、稚魚をフィード (手順 5. を参照) 一方、キューブに。注: 少年フジツボのアルテミアを摂取困難を持つことができます (手順 3. を参照) が大きいと、それゆえにはフジツボの新規入植のため飲み込むことが困難。 1 週間 × 1 水を変更します。 パネルに直径 5 mm 以上の十分に確立された少年が含まれている場合、2 週間後キューブを離れて取る」と流 throughseawater とトレイに少年とパネルを移動し、その後、 A. サリナ給餌、フジツボをフィードします。 3. 大人のフジツボのフィードとしてアルテミア給餌の文化 A. サリナの養殖システムを設定するには、1.5 L のペットボトルを切断、bottomis、ボトルは逆さまに立てと横から照らされた配置されを使用して。クランプでシリコン チューブにボトルネックを合わせて、曝気ポンプ (図 2D) に取り付けます。 卵を孵化するために 1 リットルの海水にアルテミアの乾燥休眠卵の約 15 mL を追加します。注: 24-48 時間後のノープリウス幼生にアルテミアの卵のハッチ。A. サリナの給餌 (例えば週末の間に) のハッチングを遅らせるため、光は、少し温度を減らすためにオフにできます。 アルテミアノープリウスの収穫、通気をオフにし、アルミ箔 (または同じような例えば缶) でボトルの上の部分を暗くする.点灯 10 分 Hatchedアルテミア給餌のためのびんの下の部分が光に向かって泳ぐ。非孵化嚢胞は、底に沈むだろうし、嚢胞の殻表面に浮きます。 下部クランプを開きます。スイミング給餌の密な人口として中間画を収集します。注: 毎日 (週末を除く)、高密度のアルテミア給餌停止の 1 L は大人のフジツボとトレイに接続する 100 L タンクに手動で追加します。以来、彼らは栄養を提供し、より頻繁な間隔で文化をきれいに必要とは、主に空嚢胞の殻を持つ任意の授乳を避けてください。 4. コレクションとフジツボ幼生の飼育 優しく淡水とそれらに吹きかけるによって大人のフジツボとパネルをきれいにし、必要に応じて、削除フジツボの殻と柔らかい歯ブラシを使用してパネルから任意の汚れ。また、きれいに (フジツボ) なしトレーおよびホット (75 ° c) チューブ淡水。 ポリエチレン トレイ (30 × 20 × 10 cm3) にオーバーフロー ポート 90 μ m のプランクトン ネット カット塩ビ管 (高さ 15 cm、直径 16 cm) の端に接着のふるいを配置します。ふるい一晩 (図 2C) B. improvisus幼虫を収集します。注: ふるいはフジツボのパネル止水水を受けるためや、給餌を除外するトレイの出口ポートのすぐ下に配置されました。幼虫は、小さなトレイがオーバーフロー海水中にふるいに残った。この小さなトレイ確保するふるい決して driedout。 水族館の魚のタンク ヒーター (図 2E) を使用して 26 ° c 温度大きな水浴の 30 L のバケツを配置します。曝気・攪拌は、システムを介して空気バブリングによって保証されます。 フィルター処理された海水 (0.2 μ m; 25 psu) の 20 L バケツを満たしなさい。2 珪藻微細藻類, S. marinoi , C. 薄(手順 5. を参照) の 60/40 ミックスのバケツに 1 L を追加します。これはバケツに mL あたり約 5 × 104珪藻の初期密度を与えます。注: フジツボ給餌幼虫、正の走光性。バケットは、いくつかの光を通す蓋の不透明な白いプラスチックから成っていた。冬の間は、夜間に暗いが、昼間 (8:00-17:00)、部屋が照らされていた。夏の間、外の光は日のほとんどの間に部屋に入って来た。 収集した転送 (300 mL; 直径 90 mm、高さ 50 mm の) 結晶皿にB. improvisus給餌。 光源に幼虫を誘致する側から料理を照らします。ピペットと入射光に集まる、別の結晶皿に移してフジツボ給餌を収集します。任意の残りのアルテミア幼生を削除します。 B. improvisus給餌幼虫をフィルター処理された海水 1 l ビーカーに転送します。 幼虫も懸濁液を得るため優しくビーカーを攪拌し、ビーカー内の異なる場所から 1 mL のサンプル 5 個を取って給餌の数をカウントします。顕微鏡での目視検査用マイクロ プレートに各サンプルを転送します。における 5 つのサンプルのそれぞれの数をカウントし、それらを追加します。 どのように何千もの幼虫は、全体のビーカーを推定する 200 1,000 mL (5 mL) をカウント数を掛けます。ビーカーにあまりにも多くのノープリウス幼生がある場合はサンプルを希釈する密度はせいぜい 14,000 幼虫/L (通常は 11,000-12,000 幼虫/L の範囲) まで。 1 つのバケット、バケットあたり約 11,000-12,000 幼虫を追加するB. improvisus給餌の 1 リットルを追加します。注: この幼虫に関連してあまりにも少ない結果し、死亡率を増加させるのでより多く給餌を追加することを確認します。 3 日後に、90 μ m ふるいの給餌フジツボを収集します。(75 ° C、淡水) でバケツをきれい、フィルター処理された海水を詰めて、新しい珪藻フィード (同じ量として開始時) を追加、最後にもう一度、給餌を追加します。Cyprids は約 6 日 (± 1 日) 後に表示を開始します。 (ポイント 4.2 上記のように設計されている) 90 μ m ふるいで最初 cyprids を収集します。160 μ m ふるいの上に 320 μ m ふるいでフジツボの非退給餌と cyprids を分離します。B. improvisus給餌が 320 μ m ふるい、160 μ m ふるいで cyprids で収集されます。注: cyprid 幼虫は、後で使用するcaまで暗闇の中で結晶皿に 10 ° C で保存されるかもしれない。6 日間。ただし、ストレージすることができます品質とパフォーマンスに影響フジツボ幼生のためさまざまな治療法を比較する実験は、理想的に交絡効果16を避けるために同じバッチ (と同様のストレージ時間) から幼虫を使用してください。 5. フジツボ ノープリウス幼生用飼料としての微細藻類の培養 注: 藻類成長した文化の 3 種類: スケール アップ; の接種のため使用されていた系統の長期的な保守は、文化をストック (i)(スケール アップ; の最初のステップは、ii) 開始の文化最後に (iii) フジツボ、藻類の大量の最終的な生産規模は、生産文化のフィードします。 フジツボ ノープリウス幼生の餌として使用される文化コレクションの藻類や原生動物 (CCAP) から珪藻種を注文します。2 種Skeletonema marinoi (CCAP ひずみ 1077/5) とキートセラス シンプレクスと薄(CCAP ひずみ 1085/3) の両方は、飼料として良い結果を与えます。 公称孔径 0.2 μ m. (フィルター処理された海水は、 A. サリナ卵の孵化とフジツボ ノープリウス幼生の養殖に使用するもです) とカートリッジ フィルターを用いた藻類の文化で使用されるすべての海水中にフィルターを適用します。オートクレーブ (105 ° C 5 分) での藻類培養海水のフィルター。 無機栄養素、微量金属やビタミン (ギラードリックデイビス 197517詳細レシピを参照) を含むギラードリックデイビスの f/2 ソリューションで豊かにオートクレーブ処理した海水を用いた微細藻類の培養培地を準備します。また、ケイ酸塩 (Na2SiO3)、ソリューションの準備が、これを固体沈殿物を防ぐために f/2 濃縮から別々 に保管します。注: 濃縮原液とケイ酸塩の原液の濃度は、1 リットルの海水のためにそれぞれの 1 mL 追加として使用する調製しました。 オートクレーブ 120 ° C で藻類の培養で 1 ml の f/2 濃縮と珪酸塩溶液 1 mL 20 分オートクレーブ スクリュー キャップ チューブ使用すべての機器。オートクレーブ処理したガラス製品、液体が部屋の温度に冷却するとき、赤土が流出し、濃縮およびケイ酸塩のソリューションを追加します。 スクリュー キャップが 40 mL 試験管に微細藻類のストックの文化を育てます。 濃縮海水の約 30 mL の試験管を入力します。2 週古いストックの文化の約 1 mL を使用して滅菌パスツール ピペットで文化を接種します。スクリュー キャップは装備が浮いたり、いくつかのガス交換を許可します。可能な場合、接種は層流の場合の汚染のリスクを軽減するキャビネットの実施必要があります。注: 株式文化の目的は、藻類の文化の接種材料として機能して長期的文化を開始を維持するためにです。株式文化は、2 週間毎を再接種しました。 Caの強度と白色光に新しい株式文化を公開します。25-50 µmole m-2の-1 (16:8 h の明暗サイクル)。古いストックの文化をバックアップとして低照度に移動します。任意の 2 週古いストックの文化を破棄します。 藻の生産文化スケーリングするためストックの文化からスタート文化を接種して 500 mL Erlenmeyerflasks のそれらを育てます。 オートクレーブ 4 エルレンマイヤー フラスコ、ピペット、フィルター処理 (0.2 μ m) 海水の 300 ml コットン ストッパー及び f/2 濃縮の 0.3 ml 4 試験管とケイ酸塩ソリューション 4F/2 濃縮と部屋の温度にケイ酸塩を冷却し、エルレンマイヤー フラスコにソリューションを追加します。Caにそれらを接種します。2 週間の古い株式文化の 1 mL は。注: s. marinoiと 2 のフラスコとC. シンプレックス2 を準備します。 50 µmole m-2の-1の光強度の振動台で、フラスコを置きます。開始文化が密集する藻類 (黄色色で茶色) を取得している、彼らが食物と一緒に幼虫、フジツボを提供する生産文化の接種材料として使用する準備ができています。 ガラス管が装備 2 ドリル ポートを備えたシリコーン ストッパー付き 4 L ポリカーボネート瓶の生産文化を育てます。 1 ガラス管、空気ポンプ経由でシリコン チューブが 0.2 μ m のエアフィルターを装備するボトルの底に手を差し伸べるに接続します。第 2 のガラス管の端だけシリコーン ストッパー下注入された空気の出口を許可するように綿でいっぱいだことを確認します。 毎週、塗りつぶし 4 4 L ボトル フィルター海水とオートクレーブそれら一緒にストッパー。また、オートクレーブ 4 テスト管 4 mL f/2 の濃縮およびケイ酸塩のソリューション。 冷却した後、ボトルに f/2 濃縮とケイ酸塩のソリューションを追加し、エルレンマイヤー フラスコのスタートアップ文化のボリュームの半分でそれらを接種します。 50-100 µmole m-2の-1の光強度に 4 つの 4 L ボトルを置きます。 Ca後生産文化を収穫します。1 週間。彼らは、フジツボのノープリウス幼生を摂食するため十分に密なされます。注: 生産文化は、いつでもアクティブな本番の 8 本があることを意味する約 2 週間の寿命を持っています。 6. 設計フジツボを用いた実験的研究 Identicalconditions の下で育つことができる制御の水槽に青少年や成人のフジツボとパネルを配置します。これは、例えば、ローカル adaptions または表現型可塑性18を理解したり、外部要因 (例えば、塩分濃度、温度、または pH) 関連遺伝子の発現変動を研究に使用する一般的な庭の実験に呼び出されます。注: パネルのフィールドから直接収集したフジツボを使用することが可能ですも。研究室育ちの個人を使用する利点は、次世代の子孫を使用する場合、母性効果を避けることができることです。 (例えば、遺伝子発現に関する研究の) 大人の収穫続く chosentime 間隔中に特定の環境条件にフジツボを公開2。 実験3遺伝子発現を研究する cyprid の幼虫、幼虫が同一条件下で栽培することができます制御の水槽、cyprids を配置します。 ふるい (4.7 のステップで説明します) と、フィルターで指定された時間期間の後、cyprids を収穫し、下のプロトコル (手順 8) によると RNA を抽出します。 7. フジツボの郭清 ラボ スペースを郭清と DNA のサンプリングを実行する、bothbefore をきれいにし、個人間解剖のすべてのツールを含みます。これは、ベンチ (または鉗子の 96% エタノール) に塩素を使用しています。注: 固定メディア (エタノールまたは RNA 安定化ソリューション) を含むラベルのチューブは事前に準備されます。 大きくて短期飢えた個人 (か餌を解剖前に 2 日間) を選択します。(例えば細菌、藻類) 他の種からの汚染のリスクを最小限にし、水で洗い流して歯ブラシでフジツボ シェルをクリーンアップします。注: 解剖前に個人の短期的な不足の理由 (例えば、腸内でアルテミア嚢胞から)、DNA の汚染を避けるためです。 均一な表面、パネルに接続されているまたは皿にルーズに個々 のフジツボを配置します。大人からそれぞれの組織を解剖します。研究の目的によって、フジツボを解剖するいくつかの方法があります。 郭清方法 a: 全体のフジツボを可能な限り迅速に修正します。 パネルから、フジツボ下とパネル表面の近くにそれを挿入する、メスを使用して全体のフジツボを削除します。注: ほとんどの場合、この操作の葉基底板したがって内部フジツボを与えず、ほぼ無傷。 慎重に鉗子 (図 3) を挿入することによって 1 つの側面に外側の殻を割る。これは、シェルの中の注視の中の侵入を容易にするため。注: 試験管に、フジツボを配置する前に、シェルは全然壊れていない場合、それは遅い固定プロセスと後 DNA の劣った質につながる可能性があります。 壊れたフジツボを RNA ストレージ ソリューションまたはエタノールを含むテスト チューブに入れてください。その固定のため、少なくとも 24 時間のためのソリューションで、フジツボを残します。とき、フジツボを固定すると、動物を固定メディアの取り出しし、郭清トレイ上に配置できます。前後、マントル、相馬 (ボディ) を互いから分離し、さらに DNA または RNA の抽出のための個別のチューブに配置できます。注: 受精卵で卵ラメラが、フジツボの中存在するかを観察することが重要です。存在する場合は、サンプルでは複数の遺伝子型が見つからないように DNA の抽出に進む前にこれら削除必要があります。 郭清方法 b: その固定する前にシェルから、フジツボを削除します。注: このメソッドが常にされません、calcareousshell の内側への取り付けは、サンプリングされるマントル。しかし、それは個人から DNA をサンプリングするための簡単な方法をすることができます。 それらを削除する tergal や scutal 板間鉗子の先端を挿入し、鷲掴みにして、プレートの引っ張って優しく剥離鉗子、tergal と scutal のプレート (図 3) を使用して慎重に取り外します。 グラブはまっすぐ鉗子とプル、フジツボ、前後のホールドし、96% のエタノールまたは固定のためのソリューションを安定させる RNA に直接置いて.注: 場合によっては、マントルもサンプリングされます同時に見られるように ( B. improvisus) で暗い色素沈着の薄い上皮として。そうでなければ、マントル メスを使用してシェルの内側から削除でき、その後、エタノールまたは RNA ソリューションを安定化に置かれました。注: tergal と scutal プレート (そのまま) の場合乾燥して保存できる10種の同定に便利ですので。一般的な勧告は、種の疑いがある場合は、解剖を初期化する前に全体のフジツボはまた、写真することです。 8 量的な PCR 用 RNA の抽出 ソリューションを安定させる RNA に RNA の抽出に使用する大人、4 ° C で一晩 (最大 24 時間) それらを孵化させなさいし、-80 ° C で保存注: Cyprid 幼虫が優先的にドライ ・冷凍、-80 ° C の後で直接 RNA なし cryotubes にそれらを配置し、簡単にチューブを水没 (30 s)-80 ° C で保存する前に液体窒素で RNA の抽出時に、氷にフジツボを解凍し、それらをそのまま使用または使用される組織を分析 (手順 7 を参照)。注: 個人 (地域のコーディングの ≈ 3-5% の変化間の遺伝的多様性のためAlm Rosenbladら、未発表データ) poola 大人の個体数のシーケンス後の qPCR 手順における個体間変動の影響を最小にすることをお勧めです。 RNAextraction、2.8 mm のセラミック ビーズを含む均質化管に、RNA の準備キット付属の換散バッファーの 350 μ L を追加します。注: セラミック ビーズは、RNA 超音波 (代表結果) と比較してのよりよい収穫を提供します。 (全体または組織) 大人フジツボを取るまたは鉗子を使用して 20 の cyprid の幼虫の最小値を収集し、均質化のチューブに入れてください。 ビーズミルと混乱と均質化に直接進みます。 ビーズ エンドミル ホルダーのサンプルとビーズと均質化チューブを入れてください。それらを振る 4.0 m/s の周波数を持つ 20 s. クールな氷の上の 1 分のサンプル。2 倍を繰り返します。 市販の RNA 分離キットのプロトコルに従って RNA を準備します。注: リスク評価 (安全データ用紙の読み取りを含む) はヒューム フード、手袋 (は例えばを含むその他の防護服の使用を必要とする有害化学物質を識別するために RNA 抽出方法を使用する前に実行する必要があります。RNA 抽出時に添加 β-メルカプトエタノール換散バッファーの実行すべきヒューム フード)。 RNA を定量化します。実用的なソリューションを準備し、標準とサンプルを 200 μ L の総ボリュームに追加渦 2-3 秒のためにそれらとインキュベートそれら 2 分挿入管、蛍光光度計に測定値を取る。 分光光度計, とすべての蛋白質の汚染のための RNA のサンプルと自動電気泳動システム (代表結果) の RNA の整合性をチェックします。注: 質の良い準備のため RNA に勧め比 260/280 nm 2-2.2 と 1.8 程度の DNA の。蛋白質汚染し最適化する抽出プロシージャでは、低い値を示します。 9. 遺伝子発現: cDNA 合成と qPCR QPCR の cDNA を作る前にすべての remainingDNA を削除する得られた RNAwith DNase を扱います。 CDNA を準備するときない逆転写酵素が RNA サンプルを追加することによって genomic DNA の汚染をチェックします。せず逆転写酵素 cDNA の選択した遺伝子の PCR 増幅、DNA、RNA の汚染があります。注: サンプル RNA シーケンス (次世代シーケンシング技術を使用して RNA 配列) に使用する、DNase ステップは重要度の低い。特に、RNA の低レベルでのサンプル、DNase ステップは失うために省略されます過程で RNA のあまり。 商業 cDNA 合成キットが通常、使用、少なくとも 50 ng で指定した範囲内で RNA の量を使用して DNase 処理 RNA の cDNA 合成を実行します。 彼らは個人間のシーケンス id が、可能な限り高い遺伝子 paralogs 間シーケンス id ができるだけ低い興味の遺伝子の部分にアニール、qPCR プライマーを設計します。特定のプライマー対 Na+の遺伝子発現研究のための対応する出版物を参照してください/K+ ATPase3とアクアポリン2 (図 5)。注: この目的のため cyprids の何百ものまたは複数の大人からの RNA シーケンス シーケンス データを使用することができます。 (例えばアクチン) 発現レベルの正規化に使用する遺伝子のためのプライマーを設計します。アクチンの正常に使用されるプライマーは、前方: 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3’、および逆: 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’。注: アクチンは一般的に使用される制御遺伝子であります。しかし、他の人も参照として提案およびテストされたうちフジツボ19。アクチン、ほかの参照として RPL8、36B4、EF1 は、NADHd1 の使用は、テスト3をされています。相馬、前後、大人、または cyprids の間それぞれの関連遺伝子の発現レベルに大きな差がないことが示唆されました。 SYBR グリーン、dNTP、ポリメラーゼ、前方および逆のプライマーの 0.3 μ を含むミックス (通常は 0.25-50 ng の範囲) cDNA の増加する量を追加することによって設計されたプライマーのアニーリングの温度を最適化します。 異なる熱処理温度で qPCR プロトコルを次のように実行: 95 ° C、3 分、20 95 ° C の変性のステップの初期変性温度アニーリング 20 55-63 ° C の温度、s s、および 30 のための 72 ° C 伸び s。合計では、40 の PCR のサイクルを実行します。注: プライマー効率 90-105% の範囲にある必要がありますおよび E として計算されます = (10^(-1/slope)-1) サイクルしきい値 (Ct) 値に対して cDNA 濃度のログの値をプロットするときに得られる曲線の傾きの斜面のある x 100。 QPCR 通常 1-10 ng、見つかった最適な熱処理温度と手順 3 で説明した PCR のプロトコルを使用して cDNA の適切な量を使用してを実行します。注: cDNA の多量は、非常に低い金額で表現される遺伝子の使用だけです。