Создание клоновых культуры одноклеточные водоросли спрягать
Summary
В этой статье мы продемонстрировать создание клоновых культур одноклеточными спрягать видов водорослей, собранные от естественного поля сайта.
Abstract
Важно установить клоновых культур микроводорослей для использования в исследованиях по различным темам, например, физиологии, генетики, таксономии и микробиологии. Таким образом чрезвычайно важно разработать методы для установления клоновых культур. В этой статье мы продемонстрировать создание клоновых культур спрягать Алга. Пробы воды собираются из поля. Впоследствии клетки изолированы с помощью стекла капиллярные пипетки, размещены в средствах массовой информации и выросли в условиях подходит для генерации клоновых культуры.
Introduction
Спряжение водорослей (ордена Zygnematales), также известен как conjugatophytes, занимают ключевых Филогенетическое положение как ближайших живущих родственников немедленное предки наземных растений1,2. Установленным клоновых культуры водорослей привели к широкий спектр таксономических, физиологических и генетических исследований за последние годы. Методы изоляции микроорганизмов от естественного поля имеют давнюю традицию3,4. В последние годы автоматизированных изоляции, что методы, с помощью проточной цитометрии также были созданы5. Наиболее распространенный метод, используемый для получения одной ячейки для создания клоновых культуры является одной ячейки изоляции с помощью стеклянные капиллярные пипетки6. Этот традиционный метод требует мастерства и точное экспериментальный протокол.
В этой статье мы демонстрируем выборки водорослей из поля образцов и создание клоновых культур спрягать одноклеточные водоросли, такие как Closterium видов, с использованием стеклянные капиллярные пипетки. Пробы воды, содержащие растительные клетки собирается из области сайта (например, озеро, пруд или рисовом поле). Клетки изолированы от образца воды с помощью стеклянные капиллярные пипетки и затем промывают. Клетки культивируемых в пробирки, содержащие азот дополнить среднего (CA средний) при 24 ° C под свет: 8 16-h-h темный режим. Этот метод также подходит для изоляции другие микроводорослей для создания клоновых культур.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью нынешнего метода, 9 клоновых культуры штаммов Closterium sp. были созданы из 15 клеток, изолированных от образца воды (Inba1), представляющий 60% успеха. В будущем будет осуществляться идентификации видов морфологических наблюдения, а также анализ ДНК, например молекулярного филогенетического анализа8.
В рамках нынешнего метода свежесть образца воды имеет важное значение для успеха. Это лучше изолировать клетки из проб воды как можно скорее после коллекции полей. Хотя клетки Closterium видов (например, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum Земляничная комплекс) может быть сохранен в образце воды для примерно 7 d, сохраняя его в 4-8 ° C, желательно изоляция клетки в день из коллекции или на следующий день. Это также важно для удаления любых загрязнений, за исключением клеток-мишеней, таким образом увеличивая количество повторений стиральная (то есть, > 3 x) может предотвратить загрязнение культур микроорганизмов в почве и клетки.
Ограничением этой методики является то, что средства массовой информации культуры, используемые в настоящем Протоколе (CA или кондиционером CA среднего) не всегда подходят для всех спрягать водорослей. В некоторых случаях может потребоваться рассмотреть вопрос об использовании другой среды, а также различные свет и температурных условий. Кроме того как это трудно доказать ли культуры выросла из одной одной ячейки, нужно точно подобрать только 1 клеток при переводе ячейки в пробирке. Таким образом перенос должно быть сделано с новой стекла капиллярные пипетки каждый раз.
Создание клоновых культуры с этой пипетки, мытье метод является методом классической/стандарт и является самым надежным методом для использования изолировать нужные ячейки для исследования. Клоновых культур спрягать водорослей, используемые в многих исследований8,9,10,11 были созданы с использованием нынешнего метода. Это трудно анализировать спрягать водоросли без клоновых культуры. Кроме того в последние годы, de novo весь геном последовательности стал легко получить (например, с помощью программы sequencer Нанопор Миньон), и создание клоновых культуры будет и далее содействовать последовательности de novo . Другими словами этот метод является первым шагом в будущем изучение этих водорослей, чтобы лучше понять их биоразнообразия.
Для того чтобы создать стабильную культуры штамма, необходимо выполнить определенные критические шаги точно в рамках протокола. Наиболее важным шагом является подготовка стеклянные капиллярные пипетки с отверстием оптимального разрешить прохождение только одну ячейку. Диафрагма стеклянные капиллярные пипетки должна быть немного больше, чем длина малой оси клетки интереса. Капиллярные пипетки оптимальное стекло может аспирационная одну ячейку действием капиллярных. Однако если диаметр диафрагмы является слишком большим, капилляр также привлекут в неживые загрязнения материалов или даже () других organism(s), в дополнение к целевой ячейки.
Для получения стекла капиллярные пипетки с оптимальной диафрагмы, необходимо отметить следующие моменты. Во-первых столп пламени должны быть узкими, при нагревании стеклянные капиллярные пипетки. Далее когда потянув пипетка Пастера, он должен быть удален от пламени; в противном случае будет крах отверстие пипетка Пастера.
Оборудование и контейнеры, показано в этом протоколе основные и могут быть изменены. Например с помощью нескольких хорошо пластин вместо часы очки с одной скважиной, мойки клетки можно сделать более эффективным. Кроме того контейнеры можно заменить для других аналогичных. Передавая одну ячейку питательной среды на последнем шаге, клоновые культуры могут быть установлены.
Подготовка стерилизованный контейнер и работающих в капюшоне создаст стерильных штаммов (незагрязненный). Чтобы предотвратить заражение, необходимо повторить шаг Стиральная с свежие аликвоты более чем 3 x. Иногда бактерии также стерилизовать, добавив15антибиотиков.
Этот метод сосредоточена на desmid изоляции (Zygnematales), но, изменив размер проема стеклянные капиллярные Пипетка он может применяться к изоляции разного размера планктона.
Acknowledgements
Мы благодарим Хисайоши Нозаки (Университет Токио) и Такаси Накада (Университет Кэйо), Юка Онодэра Хасимото (Япония женский университет), Хироюки Sekimoto (Университет Япония женщин). Мы хотим поблагодарить рецензентов для получения их замечаний. Это исследование было поддержано субсидий для научных исследований (№ 26440223 и 15H 04413) из японского общества для содействия развитию науки, Япония и Грант от Фонда развития новых технологий для Yuki Tsuchikane.
Materials
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. . Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).
- Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).
