הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating
Summary
במאמר זה נדגים הקמתה של תרבויות המשובטים המינים חד־תאיות conjugating אצה שנאספו מתוך אתר שדה טבעי.
Abstract
זה חיוני להקים תרבויות המשובטים microalgae לשימוש במחקרים של נושאים שונים, כגון פיזיולוגיה, גנטיקה, טקסונומיה, מיקרוביולוגיה. לכן, חשוב מאוד לפתח טכניקות כדי ליצור תרבויות המשובטים. במאמר זה נדגים הקמת המשובטים התרבויות אצה conjugating. דגימות מים נאספים מן השדה. לאחר מכן, תאים מבודדים באמצעות פיפטה נימי זכוכית, מניחים בכלי התקשורת, גדלו בתנאים מתאימים ליצירת תרבות המשובטים.
Introduction
Conjugating אצות (על אף המסדר Zygnematales), הידוע גם בשם conjugatophytes, לכבוש את עמדת פילוגנטי מפתח כמו קרובי משפחה הקרובים ביותר חיים של אבות מיידית של קרקע צמחים1,2. תרביות המשובטים של אצות הובילו על מגוון רחב של מחקרים בטקסונומיה, הפיזיולוגית גנטית במהלך השנים האחרונות. הטכניקות בידוד מיקרואורגניזמים מתוך שדה טבעי יש מסורת ארוכה3,4. בשנים האחרונות, בידוד אוטומטי באמצעות cytometry זרימה טכניקות היו גם הקים5. השיטה הנפוצה ביותר והשיג תא בודד להקמתה של תרבות המשובטים הוא בידוד תא בודד באמצעות פיפטה נימי זכוכית6. שיטה מסורתית זו דורשת מיומנות, פרוטוקול נסיוני מדויק.
במאמר זה נדגים הדוגמאות של אצות מן השדה ודוגמאות הקמתה של תרבויות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו conjugating, כמו מינים Closterium , באמצעות פיפטה נימי של זכוכית. דגימת מים המכיל תאים וגטטיבי נאסף מתוך אתר שדה (למשל, אגם, בריכה או שדה אורז). התאים מבודד דגימת מים באמצעות פיפטה נימי זכוכית, ואז לשטוף. התאים מתורבתים במבחנה המכילה חנקן-בתוספת בינוני (CA בינוני) ב 24 ° C תחת אור: 8 16-ה-h משטר אפל. שיטה זו מתאימה גם בידוד אחרים microalgae ליצור תרבויות המשובטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שימוש בשיטת ההווה, תרבות המשובטים 9 זנים של Closterium sp. הוקמו מתאי 15 מבודד דגימת מים (Inba1), המייצג את שיעור 60% הצלחה. לזן שיבוצע בעתיד על ידי התבוננות מורפולוגי, כמו גם ניתוח הדנ א, כגון ניתוח פילוגנטי מולקולרי8.
בשיטה הנוכחית, הרעננות של דגימת מים חשוב שיעור ההצלחה. עדיף לבודד את התאים מדגימות המים בהקדם האפשרי לאחר האוסף שדה. למרות תאים Closterium המינים (למשל, ehrenbergii ג, ג peracerosum-strigosum-littorale מורכבים) יכול להישמר במדגם מים במשך כ 7 d על-ידי אחסונם ב 4-8 ° C, הבידוד של התאים רצוי ביום של האוסף או למחרת. זה חשוב גם להסיר את כל מזהמים חוץ תאי היעד, אז להגדיל את מספר החזרות כביסה (קרי, > 3 x) עשוי למנוע זיהום של התרבויות על-ידי מיקרואורגניזמים קרקע, תאים.
מגבלה של טכניקה זו היא התקשורת תרבות בשימוש פרוטוקול זה (CA או ממוזגים בינוני CA) אינם תמיד מתאים כל האצות conjugating. במקרים מסוימים, ייתכן צורך לשקול שימוש באמצעי אחר, כמו גם בתנאי טמפרטורה ואור שונה. בנוסף, גם ככה קשה להוכיח אם תרבות גדל מ תא בודד, יש צורך במדויק לאסוף רק 1 התא בעת העברת תאים מבחנה. לכן, העברת צריך להיעשות עם פיפטה נימי זכוכית חדשה בכל פעם.
הקמת תרבות המשובטים עם זה פיפטה שטיפה שיטה היא שיטה קלאסית/תקן והיא השיטה האמינה ביותר לשימוש כדי לבודד את התאים הרצויים עבור מחקר. תרבויות המשובטים conjugating אצות בשימוש הרבה מחקרים8,9,10,11 הוקמו בשיטת ההווה. קשה לנתח conjugating אצות ללא תרבות המשובטים. יתר על כן, בשנים האחרונות, דה נובו רצפי הגנום כולו הפך קל להשיג (למשל, באמצעות הרצפים (sequencer) nanopore מיניון), הקמת המשובטים תרבויות נוספות יקל על רצף דה נובו . במילים אחרות, שיטה זו היא הצעד הראשון ללמוד בעתיד של אצות אלה כדי להבין טוב יותר את המגוון הביולוגי שלהם.
על מנת ליצור זן תרבות יציב, זה צורך לבצע שלבים קריטיים מסוימים במדויק בתוך הפרוטוקול. הצעד החשוב ביותר הוא הכנת פיפטה נימי זכוכית עם צמצם אופטימלי כדי לאפשר המעבר של תא בודד בלבד. הצמצם של פיפטה נימי הזכוכית בטח מעט יותר מאשר אורך ציר מינור של התא עניין. פיפטה נימי האופטימלית זכוכית ניתן תשאף תא בודד על-ידי נימיות. עם זאת, אם הקוטר של הצמצם הוא גדול מדי, נימי ימשוך גם חומרים שאינם חיים מזהם או אפילו (an) אחרים organism(s), בנוסף לתא המטרה.
כדי להשיג על פיפטה נימי זכוכית עם צמצם אופטימלי, הנקודות הבאות הן חשוב לציין. ראשית, התווך של להבה להיות צרים בעת חימום על פיפטה נימי זכוכית. בשלב הבא, בעת משיכת פיפטה של פסטר, יש להסיר הלהבה; אחרת, הצמצם של פיפטה פסטר תתמוטט
הציוד ואת מכולות שמוצג פרוטוקול זה פשוטים, שניתן לשנותם. לדוגמה, באמצעות לוחות רב טוב במקום שעונים משקפיים עם באר אחת, הכביסה תא שניתן יהיה יעיל יותר. בנוסף, המכולות הרבה מכדי האחרים דומים. על ידי העברת תא בודד למדיום תרבות-השלב האחרון, ניתן ליצור תרבות המשובטים.
הכנת במיכל מעוקר ועבודה בשכונה תקים זנים (מזוהמת) axenic. כדי למנוע זיהום, יש צורך חזור על השלב כביסה עם aliquots טריים יותר מ- 3 x. לפעמים, חיידקים גם סטריליים על-ידי הוספת אנטיביוטיקה15.
שיטה זו מתמקדת desmid בידוד (Zygnematales), אבל על ידי שינוי גודל הצמצם פיפטה נימי זכוכית, ניתן להחיל אותה את בידודה של פלנקטון בגודל שונה.
Acknowledgements
אנו מודים Hisayoshi Nozaki (אוניברסיטת טוקיו), טאקאשי Nakada (אוניברסיטת קיו), יוקה Marukawa השימוטו (אוניברסיטת של יפן נשים) ו הירויוקי Sekimoto (אונ’ יפן לנשים). אנחנו רוצים להודות הבודקים להערות שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הסיוע למחקר מדעי (מס 26440223 ו- 15H 04413) מן האגודה יפן עבור קידום של המדע, יפן, על ידי מענק מטעם קרן פיתוח טכנולוגיה חדשה יוקי Tsuchikane.
Materials
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. . Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).
- Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).
