Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Algen Konjugation
Summary
In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Konjugation Algenarten aus einer natürlichen Wiese gesammelt.
Abstract
Es ist unentbehrlich, klonale Kulturen von Mikroalgen für den Einsatz in Studien mit verschiedenen Themen, wie Physiologie, Genetik, Taxonomie und Mikrobiologie. Daher ist es äußerst wichtig, die Entwicklung von Techniken zur klonale Kulturen zu schaffen. In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der conjugating Alge. Wasserproben werden aus dem Bereich gesammelt. Anschließend werden Zellen isoliert mit einer Kapillare Glaspipette, in Medien und Bedingungen geeignet zur Erzeugung einer klonalen Kultur angebaut.
Introduction
Konjugation von Algen (des Ordens Zygnematales), besetzen auch bekannt als Conjugatophytes, eine phylogenetische Schlüsselposition als die nächsten lebenden Verwandten der unmittelbaren Vorfahren des Land Pflanzen1,2. Etablierten klonale Kulturen von Algen führten zu einer Vielzahl von taxonomischen, physiologischen und genetischen Studien in den vergangenen Jahren. Die ISOLIERUNGSTECHNIKEN von Mikroorganismen aus einer natürlichen Wiese haben eine lange Tradition-3,–4. In den letzten Jahren etablierte automatisierte Isolierung, die Techniken mit Durchflusszytometrie auch gewesen5. Die am häufigsten verwendete Methode verwendet, um eine einzelne Zelle für die Errichtung einer klonalen Kultur zu erhalten ist die einzellige Isolierung mit einer Glas-Kapillare Pipette-6. Diese traditionelle Methode erfordert Geschick und eine präzise experimentelles Protokoll.
In diesem Artikel zeigen wir die Probenahme von Algen aus Feldproben und die Einrichtung von klonalen Kulturen von einzelligen Algen Konjugation, wie Gattung Closterium mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette. Eine Wasserprobe mit vegetativen Zellen wird von der Wiese (z.B., ein See, Teich oder Reisfeld) gesammelt. Die Zellen sind von der Wasserprobe mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette isoliert und dann gewaschen. Die Zellen sind in einem Reagenzglas mit Stickstoff ergänzt Medium (CA Medium) kultiviert, bei 24 ° C unter einem 16 h Licht: 8-h dunkel Regime. Diese Methode eignet sich auch zur Isolierung von anderen Mikroalgen zur klonale Kulturen zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der vorliegenden Methode entstanden 9 klonalen Kultur Stämme von Closterium SP. aus 15 Zellen isoliert von der Wasserprobe (Inba1), vertritt eine 60 % ige Erfolgsquote. Artenkenntnisse wird in Zukunft durch morphologische Beobachtung als auch DNA-Analysen, wie Molekulare phylogenetische Analyse8erfolgen.
In dem vorliegenden Verfahren ist die Frische der Wasserprobe wichtig, die Erfolgsquote. Es ist besser, die Zellen von Wasserproben so bald wie möglich nach der Feldauflistung zu isolieren. Obwohl die Zellen der Gattung Closterium (z. B. C. Ehrenbergii, C. Peracerosum-Strigosum-Littorale Komplex) in der Wasserprobe für ca. 7 d beibehalten werden können, indem es bei 4-8 ° C gespeichert, ist die Isolation der Zellen wünschenswert am Tag der Abholung oder am nächsten Tag. Es ist auch wichtig, sämtliche Verunreinigungen außer den Zielzellen, also die Zahl der Wiederholungen Waschen zu entfernen (d.h., > 3 X) kann eine Kontamination der Kulturen von Mikroorganismen im Boden und Zellen zu verhindern.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass die in diesem Protokoll (CA oder konditionierten CA Medium) verwendeten Nährmedien sind nicht immer geeignet für alle conjugating Algen. In einigen Fällen kann es notwendig zu prüfen, mit einem anderen Medium, sowie anderen Licht und Temperaturbedingungen sein. Auch, da es schwierig zu beweisen, ob eine Kultur von einer einzigen Zelle entwickelt hat, ist es notwendig nur 1 Zelle genau abholen, beim Übertragen von Zellen in einem Reagenzglas. Daher sollte die Übertragung mit einem neuen Kapillare Glaspipette jedes Mal durchgeführt werden.
Zur Gründung einer klonalen Kultur mit dieser Pipette waschen Methode ist eine klassische/Standard-Methode und ist die zuverlässigste Methode zu verwenden, um die gewünschten Zellen für eine Studie zu isolieren. Die klonalen Kulturen der Konjugation Algen verwendet in vielen Studien8,9,10,11 wurden gegründet, mit dem vorliegenden Verfahren. Es ist schwierig, Konjugation Algen ohne einer klonalen Kultur zu analysieren. Darüber hinaus in den letzten Jahren ganze Genomsequenzen de Novo wurde leicht zu beschaffen (z. B.durch die Verwendung des MinION Nanopore Sequencers) und zur Gründung klonaler Kulturen erleichtert weiter de Novo Sequenzierung. Das heißt, ist diese Methode der erste Schritt in die Zukunft studieren dieser Algen, ihre biologische Vielfalt besser zu verstehen.
Um eine stabile Kultur Belastung zu etablieren, ist es notwendig bestimmte kritische Schritte genau innerhalb des Protokolls. Der wichtigste Schritt ist die Vorbereitung der Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende um den Durchgang von nur einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Die Öffnung der Kapillare Glaspipette muss etwas mehr als die Länge der Nebenachse der Zelle von Interesse sein. Die optimale Kapillare Glaspipette kann eine einzelne Zelle durch Kapillarwirkung Aspirieren. Wenn der Durchmesser der Öffnung zu groß ist, wird die Kapillare in unbelebter Verunreinigung Materialien oder auch (eine) andere besonders, neben der Zielzelle auch zeichnen.
Um eine Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende zu erhalten, sind folgende Punkte zu beachten. Erstens muss die Säule der Flamme schmal sein, beim Erhitzen von Kapillaren Glaspipette. Als nächstes beim Pasteurpipette ziehen, muss es aus der Flamme entfernt werden; Andernfalls wird die Blende von der Pasteurpipette zusammenbrechen.
Die Ausrüstung und Container gezeigt in diesem Protokoll sind einfach und können geändert werden. Beispielsweise kann mithilfe von Multi-well-Platten anstelle von uhrgläser mit einem Brunnen, der Zelle waschen effizienter gestaltet werden. Darüber hinaus können die Container für andere ähnliche ersetzt werden. Durch eine einzelne Zelle auf dem Kulturmedium im letzten Schritt zu übertragen, kann eine klonale Kultur aufgebaut werden.
Vorbereitung eines sterilisierten Containers und arbeiten in einer Kapuze werden axenic (unbelasteten) Stämme etablieren. Um Verunreinigungen zu vermeiden, ist es notwendig die Waschschritt mit frischen Aliquote mehr als 3 X wiederholen. Manchmal sind Bakterien auch durch Zugabe von Antibiotika15sterilisiert.
Diese Methode konzentriert sich auf Desmid (Zygnematales) isoliert, aber ändern Sie die Größe der Blende Glas Kapillare Pipette, um die Isolation der unterschiedlich großen Plankton angewendet werden.
Acknowledgements
Wir danken Hisayoshi Nozaki (Universität Tokio), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan Frauen Universität) und Hiroyuki Sekimoto (Japan Joshi Daigaku). Wir möchten die Kritiken für ihre Beiträge danken. Diese Studie wurde durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung (Nr. 26440223 und 15 H 04413) von der Japan Society for Promotion of Science, Japan, und durch einen Zuschuss von der neuen Technologie Development Foundation, Yuki Tsuchikane unterstützt.
Materials
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
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