לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ex-vivo סידן הדמיה של המוח דרוזופילה . בשיטה זו, תרכובות טבעי או סינתטי ניתן להחיל את המאגר כדי לבחון את היכולת שלהם להפעיל את המסוים הנוירונים במוח.
Abstract
עוגב-כדי-איבר תקשורת על-ידי איתות האנדוקרינית, לדוגמה, מהפריפריה למוח חיונית על שמירה על הומאוסטזיס. כחיה דגם למחקר האנדוקרינית, דרוזופילה melanogaster, אשר מורכבת גנטי כלים ומידע הגנום, משמשת יותר ויותר. מאמר זה מתאר שיטת ההדמיה סידן של explants המוח דרוזופילה . שיטה זו מאפשרת זיהוי ישיר באיתות של הורמון במוח. זה ידוע כי רבים פפטיד ההורמונים לפעול דרך G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), הפעלת אשר גורמת לעלייה בריכוז2 +Ca תאיים. הפעלה עצבית גם מגביה תאיים Ca2 + רמות, Ca2 + זרם והן על שחרורו של Ca2 + המאוחסן תוך-פלזמית (ER). חיישן סידן, GCaMP, באפשרותך לפקח על Ca2 + שינויים אלה. בשיטה זו, GCaMP מתבטאת הנוירונים עניין, וה -המוח זחל GCaMP-לבטא ביתר תרבותי ex-vivo. מבחן פפטיד מחילה על explant המוח, שינויים פלורסנט GCaMP מזוהים באמצעות ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד with a מצלמה CCD. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון את כל מולקולה מסיסים במים, הסלולר אירועים שונים הקשורים עם הפעלה עצבית יכולה לדימות באמצעות האינדיקטורים פלורסנט המתאים. יתר על כן, על-ידי שינוי התא הדמיה, ניתן בשיטה זו לשיקוף איברים דרוזופילה אחרים או האברים של בעלי חיים אחרים.
Introduction
עוגב-כדי-איבר תקשורת היא אסטרטגיית אבולוציונית שנשמרת על שמירה על הומאוסטזיס להתמודד עם שינויים סביבתיים. בבני אדם, מגוון רחב של הורמונים arereleased של בלוטות אנדוקריניות למחזור. רבים של הורמונים אלה יעד ההיפותלמוס במוח, אשר מווסת תהליכים מטבוליים והתנהגויות יסוד כגון האכלה1,2. הורמונים רבים כבר גילו באמצעות מודלים בתרבית. עם זאת, מנגנוני הפעולה שלהם, במיוחד הרשתות interorgan בהם הם משתתפים, נותרו בלתי ברורים במידה רבה.
דרוזופילה melanogaster התפתחה מודל שימושי עבור לימוד אורגן-כדי-איבר תקשורת. בחרקים, תהליכים פיזיולוגיים רבים נשלטים על ידי הורמונים. לימודי התמקדות צמיחה ושינוי צורה להשתמש חרקים גדולים. במחקרים אלה, הסרה או השתלת איברים ספציפיים ניבא את קיומו של מולקולות איתות בין איברים; מאוחר יותר, הורמון נעורים (JH), הורמון Prothoracicotropic (PTTH) Ecdysone היו מבחינה ביוכימית מטוהרים3,4,5. משפחה גדולה של פפטידים איתות המערכת נחשב להיות מעורבים באירועים פיזיולוגיים שונים במהלך מחזור חיי חרק6,7. רוב פפטידים אלה פועלים על G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), למרות GPCRs ספציפי היו בתחילה קשה לזהות באמצעות גישות קונבנציונליות. הפרסום של רצף הגנום כולו דרוזופילה 8 היה פריצת הדרך שאיפשר את הזיהוי של פפטידים ביו דרוזופילה בהתבסס על שלהם הומולוגיה לאלה שנמצאו ושאר חרקים. בנוסף, קולטני עבור מספר פפטידים אותרו מ GPCRs חזה הגנום באמצעות מבחני הכריכה GPCR-ליגנד המבוססות על התא-תרבות. בשלב הבא, ביטוי ניתוח חזה המסלולים איברים-כדי-איבר שהפיק אלה פפטידים, קולטנים. ראוי לציין, רבים של קולטני פפטיד בשם באים לידי ביטוי במוח, רומז המוח הוא יעד מרכזי של פפטיד ההורמונים9. יתר על כן, כלים גנטיים מתקדמים בדרוזופילה תרמו זיהוי תפקידים פיזיולוגיים של שילובים פפטיד-GPCR. למשל, GAL4 ואת לקסה בינארי תעתיק מערכות מבוססות להפעיל גנים או ביטוי בצורה מבוקרת במרחב של חנותם. GAL4, גורם שעתוק שזוהתה שמרים, נקשר לרצף cis-רגולציה ספציפי שנקרא רצף ההפעלה נגד הזרם (UAS). במערכת GAL4/UAS, הקו מנהל התקן מספק רקמות ספציפיות או ביטוי GAL4 שלב ספציפי לבין הקו המשיב נושא UAS במעלה הזרם של הגן מעניינים או הבונה לביטוי shRNA נסיעה. לקסה/LexAop מערכת מבוססת על מנגנון דומה. ניתוחים פנוטיפי של פפטיד-נוקאאוט רקמות ספציפיות ובעלי GPCR-נוקאאוט רקמות ספציפיות יכול לחשוף מידע אודות מצב של פפטיד-GPCR באיתות האתר של פעילות. אולם, המסקנות כי ניתן להגיע אך ורק על ידי מידע גנטי מוגבלים. מצד שני, ברגע בשם היעד של הורמון מסוים הוא צימצמת לסוג הרקמה או תא, שמחוץ סידן דימות in איברים explants ניתן להבהיר את התקשורת איברים-כדי-איבר מתווכת על-ידי איתות פפטיד-GPCR. בעת ההפעלה של GPCR מצמידים Gq, הריכוז2 + Ca תאיים גדל בשל שחרורו של Ca2 + מ ה ER10. במוח, הפעלה עצבית גם מעלה רמות2 + Ca תאיים. Ca2 + עליות כאלה ניתן להבחין באמצעות חיישן סידן, GCaMP, אשר עובר שינויים הסתגלותי בנוכחות Ca2 + וכתוצאה מכך פליטת קרינה פלואורסצנטית11.
במאמר זה מתואר של סידן שיטת הדמיה באמצעות המוח דרוזופילה explants. כדי לבדוק את היכולת של פפטיד להפעלת נוירונים ספציפיים, פפטיד המבחן חל את explant המוח לבטא GCaMP, שינויים פלורסצנטיות המפוקחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. המעורבות של GPCR אז אושר על ידי ביצוע וזמינותו אותו באמצעות מוח מוטציה חסר את GPCR. שילוב זה של הדמיה וגנטיקה מספק מידע מדויק על איבר-כדי-איבר תקשורת על-ידי פפטידים-GPCRs. האפשר שינויים ויישומים של פרוטוקול זה נדונות גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 + הדמיה בשיטה המתוארת כאן היא מערכת שימושית לבדיקה את הפונקציה של הורמונים במוח. אין ויוו, המוח מקבל הורמונים של האורגנים האנדוקרינית. בנוסף, המוח רואה כל הזמן עולה המידע החושי, הגורמת הפעלה עצביים ספונטנית. מערכת זו שמחוץ מבטל רעש נורא ותשואות יחס אות/רעש טוב יותר מאשר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היה נתמך על ידי Grants-in-Aid למחקר מדעי (15K 07147, 17K 07419) מ- JSPS (כדי הירושי Ishimoto, סנו לובה פריז), על Inamori קרן המחקר מענק (איץ ‘ אי), ואת התוכנית של המרכז השימוש/מחקר משותף ללימודי רפואה התפתחותית, ב המכון אמבריולוגיה מולקולרית, גנטיקה, קאמאמוטו אוניברסיטת (HS). אנו מודים ד ר אזוסה Kamikouchi, מר דאיצ’י יאמאדה לעזרה שלהם באמצעות מערכת הדמיה.
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
- Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
