Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Órgano de órgano de comunicación es una estrategia evolutivamente conservada para mantener la homeostasis para hacer frente a cambios ambientales. En los seres humanos, una variedad de arereleased de las hormonas de las glándulas endocrinas en la circulación. Muchas de estas hormonas objetivo el hipotálamo del cerebro, que regula los procesos metabólicos y conductas fundamentales como alimentación^1,2. Se han descubierto muchas hormonas utilizando modelos de mamíferos. Sin embargo, los mecanismos de su acción, especialmente las redes interorgan en el que participan, siendo en gran parte confusos.

Drosophila melanogaster ha emergido como un modelo útil para estudiar la comunicación de órgano a órgano. En insectos, muchos procesos fisiológicos son controlados por hormonas. Los primeros estudios centrándose en el crecimiento y metamorfosis utilizan grandes insectos. En estos estudios, la extirpación o trasplante de órganos específicos predijo la existencia de moléculas de señalización entre órganos; más tarde, la ecdisona, la hormona juvenil (JH) y Prothoracicotropic hormona (PTTH) fueron purificada bioquímicamente^3,4,5. Una gran familia de péptidos de señalización intercelulares se piensa para estar implicado en varios eventos fisiológicos durante el ciclo de vida de insectos^6,7. La mayoría de estos péptidos actúa sobre G-proteína-juntó los receptores (GPCRs), aunque los GPCRs específicos fueron inicialmente difíciles de identificar utilizando métodos convencionales. La publicación de la Drosophila genoma secuencia⁸ fue el gran avance que permitió la identificación de péptidos bioactivos de Drosophila basado en su homología a las encontradas en otros insectos. Además, se identificaron los receptores para varios péptidos de GPCRs previstos en el genoma usando análisis de unión de ligando GPCR basada en cultivo celular. A continuación, análisis de expresión predijeron las vías de órgano a órgano sacadas por estos péptidos y receptores. En particular, muchos de los receptores de péptido putativo se expresan en el cerebro, lo que sugiere que el cerebro es un blanco importante de péptidos hormonas⁹. Por otra parte, las herramientas avanzadas de genéticas en Drosophila han contribuido a la identificación de roles fisiológicos de combinaciones de péptido GPCR. Por ejemplo, el GAL4 y sistemas binarios transcripcionales de LexA permiten knockdown de genes o sobreexpresión de forma espacial y temporal controlada. GAL4, un factor de la transcripción en levadura, se une a una secuencia específica de cis-regulador llamada secuencia de activación ascendente (UAS). En el sistema de GAL4/UAS, la línea del controlador proporciona tejidos específicos o expresión de GAL4 etapa-específica y la línea de respuesta lleva UAS corriente arriba del gen de interés o de la construcción en expresión de shRNAs en coche. LexA/LexAop sistema se basa en un mecanismo similar. Análisis fenotípicos de los animales de tejidos específicos péptido-caída y tejidos específicos GPCR-caída pueden revelar información sobre modo del GPCR péptido de señalización y sitio de acción. Sin embargo, las conclusiones que se pueden llegar únicamente por datos genéticos son limitadas. Por otra parte, una vez que el supuesto objetivo de una hormona peptídica particular es limitado a un tipo de tejido o célula, puede utilizarse para aclarar la comunicación de órgano a órgano mediada por péptidos GPCR signaling ex vivo calcio en explantes de órgano. La activación de un GPCR acoplado a Gq, se incrementa la concentración de Ca^{2 +} intracelular debido a la liberación de Ca^{2 +} de la ER¹⁰. En el cerebro, la activación neural también eleva los niveles de Ca^{2 +} intracelulares. Tal Ca^{2 +} aumenta puede detectarse mediante un sensor de calcio, GCaMP, que sufre cambios conformacionales en presencia de Ca^{2 +} en fluorescencia emisión¹¹.

En este artículo, se describe un calcio explantes método proyección de imagen del cerebro de Drosophila . Para probar la capacidad de un péptido para activar las neuronas específicas, un péptido de prueba se aplica al explante expresando su GCaMP cerebro, y cambios de fluorescencia son monitoreados mediante microscopía confocal. La participación de lo GPCR es confirmada luego por realizar el mismo análisis utilizando un cerebro mutante que carece el GPCR. Esta combinación de imágenes y genética proporciona información precisa acerca de órgano a órgano comunicación por péptidos-GPCRs. posibles modificaciones y aplicaciones de este protocolo también se discuten.