Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Orgel, Orgel-Kommunikation ist eine evolutionär konservierte Strategie für die Aufrechterhaltung der Homöostase um Veränderungen der Umwelt gerecht zu werden. Bei Menschen, eine Vielzahl von Hormonen Arereleased von den endokrinen Drüsen in den Blutkreislauf. Viele dieser Hormone gezielt im Hypothalamus des Gehirns, die Stoffwechselprozesse und grundlegende Verhaltensweisen wie Fütterung^1,2regelt. Viele Hormone sind mit Säugetieren Modelle entdeckt worden. Die Mechanismen ihres Handelns, vor allem die interorgan Netzwerke, an denen sie teilnehmen, bleiben jedoch weitgehend unklar.

Drosophila Melanogaster hat ein nützliches Modell für das Studium der Orgel, Orgel-Kommunikation entwickelt. Bei Insekten sind viele physiologische Prozesse durch Hormone gesteuert. Frühe Studien mit Schwerpunkt auf Wachstum und Metamorphose verwendet große Insekten. In diesen Studien vorhergesagt die Entfernung oder die Transplantation von bestimmten Organen die Existenz von Inter Orgel Signalmoleküle; später wurden Juvenilhormon (JH), Prothoracicotropic Hormon (PTTH) und Ecdyson biochemisch gereinigten^3,4,5. Eine große Familie von interzellulären Signalisierung Peptide wird gedacht, um während der Insekten Lebenszyklus^6,7in verschiedenen physiologischen Ereignisse einbezogen werden. Die meisten dieser Peptide wirken auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), obwohl die spezifische GPCRs zunächst schwer zu identifizieren, mit herkömmlichen Ansätzen waren. Die Veröffentlichung der Drosophila ganze Genom-Sequenz⁸ war der Durchbruch, der die Identifizierung von Drosophila bioaktiven Peptiden basierend auf ihre Homologie mit denen in anderen Insekten aktiviert. Darüber hinaus wurden die Rezeptoren für verschiedene Peptide von GPCRs vorhergesagt im Genom mit Kultur-zellbasierte GPCR-Ligand verbindliche Tests identifiziert. Als nächstes vorhergesagt Expressionsanalysen die Orgel, Orgel-Wege ausgelöst durch diese Peptide und Rezeptoren. Insbesondere werden viele der vermeintlichen Peptid-Rezeptoren ausgedrückt im Gehirn, was darauf hindeutet, dass das Gehirn ein wichtiges Ziel von Peptid-Hormone-⁹. Darüber hinaus haben die genetische Sonderwerkzeuge in Drosophila zur Identifizierung der physiologischen Rollen von Peptid-GPCR Kombinationen beigetragen. Zum Beispiel ermöglichen die GAL4 und LexA binäre transkriptionelle basierenden gen-Knockdown oder Überexpression räumlich und zeitlich kontrolliert. GAL4, einen Transkriptionsfaktor identifiziert in Hefe, bindet an eine bestimmte Cis-regulatorische Sequenz genannt Upstream Aktivierung Sequenz (FH). In das GAL4/UAS-System die Treiber Line bietet gewebespezifischen oder Bühne-spezifische GAL4 Ausdruck und die Responder-Linie trägt UAS stromaufwärts des Gens von Interesse oder das Konstrukt Laufwerk ShRNA Ausdruck. LexA/LexAop System basiert auf einem ähnlichen Mechanismus. Phänotypische Analysen der gewebespezifischen Peptid-Zuschlag und gewebespezifische GPCR-Zuschlag Tiere können Informationen über die Peptid-GPCR Signalisierung Modus und Ort des Geschehens zeigen. Allerdings beschränken sich die Schlussfolgerungen, die allein durch genetische Daten erreicht werden können. Auf der anderen Seite sobald das vermeintliche Ziel ein bestimmtes Peptidhormon zu einem Gewebe oder Zellen Typ eingegrenzt, ex Vivo Kalzium imaging in Orgel Explantaten lässt sich die Orgel, Orgel-Kommunikation vermittelt durch Peptid-GPCR Signalisierung zu erhellen. Nach der Aktivierung eine Gq gekoppelt GPCR wird die intrazelluläre Ca^{2 +} Konzentration durch die Freisetzung von Ca^{2 +} aus dem ER¹⁰erhöht. Im Gehirn erhebt neuronalen Aktivierung auch die intrazellulären Ca^{2 +} Ebenen. Diese Ca^{2 +} Erhöhungen können durch eine Kalzium-Sensor, GCaMP, erkannt werden die Konformationsänderungen im Beisein von Ca^{2 +} was Fluoreszenz Emission¹¹erfährt.

In diesem Artikel wird ein Kalzium, die bildgebendes Verfahren mit Drosophila Gehirn explants beschrieben. Um die Fähigkeit eines Peptids, spezifische Neuronen aktivieren zu testen, wird eine Test-Peptid auf GCaMP exprimierenden Gehirn Explant angewendet und Fluoreszenz-Änderungen werden von konfokalen Mikroskopie überwacht. Die Einbeziehung der GPCR ist dann bestätigt, indem Sie den gleichen Test mit einem mutierten Gehirn fehlt der GPCR durchführen. Diese Kombination von Bildgebung und Genetik liefert präzise Informationen über die Orgel, Orgel-Kommunikation durch Peptide-GPCRs. möglich Änderungen und Anwendungen dieses Protokolls werden ebenfalls behandelt.