Summary

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Published: June 03, 2018
doi:

Summary

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Abstract

Trans-bir somatik hücre türü başka bir farklılaşma modellemek ve insan hastalıkları tedavi etmek için büyük potansiyele sahiptir. Önceki çalışmalar göstermiştir bu fare embriyonik, dermal ve kardiyak fibroblastlar fonksiyonel indüklenen-cardiomyocyte-benzeri hücreler (ICMS) reprogrammed kardiyojenik transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere GATA4, Hand2, Mef2c, overexpression ve Tbx5 vitro ve içinde vivo. Ancak, bu önceki çalışmalar nispeten düşük verimlilik göstermiştir. Yaralanma aşağıdaki kalp işlevi geri yüklemek için kalp yeniden programlama yöneten mekanizmaları verimliliği ve olgunlaşma ICMS artırmak için aydınlatılmamıştır gerekir.

Biz daha önce büyük ölçüde pro-fibrotik sinyal inhibisyon programlama verimliliği artar gösterdi. Burada, biz % 60 kadar programlama verimliliğini elde etmek için yöntemleri ayrıntılı olarak. Ayrıca, akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme ve kalsiyum görüntüleme programlama verimliliği ve programlanmış fibroblastlar olgunlaşma ölçmek için de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Burada ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak, mekanik çalışmaları kalp yeniden programlama, pozitif ve negatif düzenleyiciler belirlemek için üstlenilen. Bu çalışmalar programlama verimliliği ve olgunlaşma, roman hücre tedavilere insan kalp hastalığı tedavi etmek için neden olabilir tanıtmak için hedef sinyal yolları tespit edebilir.

Introduction

İskemik kalp hastalığı, Amerika Birleşik Devletleri1ölüm önde gelen nedenidir. Yaklaşık 800.000 Amerikalılar bir ilk veya yineleyen miyokard infarktüsü (mı) başına yıl1deneyim. MI, ölüm cardiomyocytes (CMs) ve kardiyak fibrozis, aktif kardiyak fibroblastlar tarafından tevdi zarar kalp fonksiyonu2,3. Kalp yetmezliği MI takip ilerlemesini büyük ölçüde yetişkin CMs4,5zavallı yeniden üretim kapasitesi nedeniyle edilemez. Geçerli klinik Tedaviler hastalığın ilerlemesini yavaşlatmak ve gelecekteki kardiyak olaylar6,7,8,9tehlikesini azaltmak iken, hiçbir Tedaviler hastalığın ilerleme yetersizlik nedeniyle ters CMs sonrası infarktüsü10yeniden. Roman hücre tedavileri MI. Disappointingly takip hastaları tedavi etmek için ortaya çıkıyor, klinik kök hücre MI şu ana kadar takip kalp teslim sonuçsuz rejeneratif potansiyel11,12, göstermiştir 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

İnsan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSCs) fibroblastlar tarafından overexpression ilk Takahashi & Yamanaka, tarafından gösterilen dört transkripsiyon faktörlerin nesil hücre terapisi19‘ yeni buluşlar için kapıyı açtı. Bu hücreler tüm üç germ katmanları19ayırt edebilir ve daha önce20,21gösterilen CMs çok sayıda oluşturmak için çeşitli yüksek verimli Yöntemler. CMs (kalça-CMs) HiPSC elde edilen cardiomyogenesis çalışmak için güçlü bir platform sunmaktadır ve yaralanma aşağıdaki kalp onarmak için önemli etkileri olabilir. Ancak, kalça-CMs Şu anda translasyonel Engelli teratoma oluşumu22kaygılar nedeniyle yüz ve olgunlaşmamış doğaları pro-Aritmojenik23olabilir. Fibroblastlar hiPSCs yeniden şekillendirmek için doğrudan fibroblastlar diğer hücre türleri yeniden şekillendirmek için ilgi yol açtı. Ieda ve ark. düşük verimlilik24de olsa bu overexpression GATA4, Mef2c ve Tbx5 (GMT) doğrudan kalp soy, yeniden programlama içinde fibroblastlar sonuçlarında gösterdi. Verimliliği yeniden programlama Hand2 (GHMT)25eklenmesi ile geliştirildi. Beri erken bu çalışmalar, birçok yayın programlama faktörü kokteyl ek transkripsiyon ile değiştirme26,27,28,29faktörler göstermiştir, Kromatin değiştiriciler30,31, mikroRNA32,33veya34 geliştirilmiş yol açan küçük moleküller verimliliği ve/veya indüklenen cardiomyocyte benzeri hücreler (ICMS olgunlaşma yeniden programlama ).

Burada ICMS fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) ile yüksek verimlilik oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz daha önce kokteyl GHMT miR-1 ve miR-133 (GHMT2m) eklenmesi ile belirgin bir biçimde iyileştirilmiş ve daha fazla artırıldı pro-fibrotik büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal dönüştürme de dahil olmak üzere yolları sinyal veya Rho ilişkili gösterdi Inhibe35protein kinaz (ROCK) sinyal yolları vardır. Bu iletişim kuralını kullanan, biz hücreleri yaklaşık % 60’ı kardiyak Troponin T (cTnT) hızlı, yaklaşık % 50 α-Aktinin hızlı ve dayak hücre sayısının yüksek olduğu gün 11 faktörler ve tedavi yeniden programlama, iletim takip erken görülebilir göstermek TGF-β ile ben reseptör inhibitörü A-83-01 yazın. Ayrıca, bu ICMS gap junction proteinler connexin 43 de dahil olmak üzere hızlı ve kendiliğinden kasılma ve kalsiyum geçişler sergilemek. Bu önceki çalışmalara göre verimliliği yeniden programlama düzelme işaretlenmiş CMs kalp sonrası infarktüsü kalır endojen hücre popülasyonlarının üzerinden yeniden oluşturmak için potansiyel gösteriyor.

Protocol

Tüm deneylerin hayvanlar gerektiren kurumsal hayvan bakım ve UC Denver Anschutz tıbbi kampüs kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi. 1. MEFs yalıtım C57BL/6 hamile fareler E13, Satın almak. Gecede gemi. Onaylı IACUC protokolleri göre anne ötenazi (ex: ~1.3 hayvan ölü görünene kadar L/dak CO2 izledi tarafından servikal çıkığı) Annesi % 70 etanol ile sprey ve karın boşluğu açın. Embriyo içeren rahim boynuz kaldırmak ve st…

Representative Results

Yukarıda ve Şekil 1Bözetlenen programlama stratejisi kullanarak, biz ICMS yaklaşık kardiyak Troponin T ifade hücre ve kardiyak α-Aktinin, akış sitometresi gün 9 tarafından sayısal ifade hücreleri yaklaşık % 55’i ile oluşturulan GHMT2m iletim takip (Şekil 2A ve B). Ayrıca, Hızlı hücre çoğunluğu kardiyak Troponin T, Troponin ı ve kardiyak α-Aktinin yanı sıra gün 14 iletim (<strong c…

Discussion

Bu da çalışmanın doğrudan fibroblastlar teslim GHMT2m pro-fibrotik sinyal yolları bastırılması ile kombine faktörlerin yeniden programlama yoluyla fonksiyonel ICMS içine yeniden programlamak için yüksek verimli strateji özetliyor. Kullanarak akış sitometresi, immünfloresan görüntüleme, görüntüleme ve hücre sayımları, bu protokol için hücreleri çoğunluğu gösterdiğimiz yenerek kalsiyum başarılı yeniden programlama gösterip CM lineage kader. Biz daha önce anti-fibrotik ek maddeler ve bi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma fonları programdan Boettcher Vakfı’nın Webb Waring Biyomedikal araştırma, Amerikan Kalp Derneği Bilim adamı kalkınma hibe (13SDG17400031), Colorado Üniversitesi Tıp üstün erken kariyer bölümü tarafından desteklenen Akademik Program, University of Colorado bölümü Kardiyoloji Barlow Nyle bağış ve NIH R01HL133230 (KS için). Fibrozis araştırma ve çeviri (CFReT) için A.S.R NIH/NCATS Colorado CTSA Grant numarası TL1TR001081 ve Colorado Üniversitesi Konsorsiyumu bir önceden Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da kanser merkezi destek Grant (P30CA046934), cilt hastalıkları araştırma çekirdek Grant (P30AR057212) ve akış sitometresi özünde Colorado Üniversitesi Anschutz tıbbi kampüs tarafından desteklenmiştir.

Materials

C57BL/6 Mice Charles River's Laboratory 027 For MEF isolation
Platinum E (PE) Cells Cell Biolabs, INC RV-101 For retrovirus production
DMEM High Glucose Gibco SH30022.FS Component of iCM, PE, and Growth media
Medium 199 Life Technologies 11150-059 Component of iCM media
Fetal Bovine Serum Gemini 100106 Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse Serum Gemini 100508 500 Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50X Life Technologies 11130051 Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100X Life Technologies 11360070 Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X Life Technologies 11140050 Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100X Life Technologies 11120-052 Component of iCM media
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 41400045 Component of iCM media
B27 Gibco 17504-044 Component of iCM media
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) Gibco 35050-061 Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HCl Life Technologies A11139-03 Component of PE media
Puromycin dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200-056 For detaching cells from culture dishes
A-83-01 R&D Systems – Tocris 2939/10 Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSO Thermo Scientific 85190 For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoat Cellutron SC-9035 For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2692 Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 11058-021 Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2c Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFP Plasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268-5G For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) Nalgene  569-0020  For filtering media
Syringes Bd Vacutainer Labware  309654 For viral filtration
0.45 µm Filters Celltreat 229749 For viral filtration
70 µm cell strainers Falcon  352350 For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer  BD 554723 For washing cells for flow cytometry
DPBS 1X Gibco 14190-250 For washing cells
Bovine Serum Albumin VWR 0332-100g For flow cytometry and calcium imaging
Goat Serum Sigma  G9023 For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey Serum Sigma D9663-10mg For blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin T Thermo Scientific ms-295-p 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actinin Sigma A7811L 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43 Sigma  C6219 1:400 IF
Rabbit Troponin I PhosphoSolutions 2010-TNI 1:400 IF
Hoechst Life Technologies 62249 1:10000 IF
Alexa 488, rabbit Life Technologies A-11034 1:800 IF
Alexa 555, mouse Life Technologies A-21422 1:800 IF
Alexa 647, mouse Life Technologies A-31571 1:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer  Bio-RAD For FACS
Paraformaldehyde sigma P6148-500mg For fixing cells for IF
Triton X-100 Promega H5142 For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging System Thermo Scientific AMEFC4300 For IF
NaCl RPI S23020-5000 For calcium imaging
KCl VWR 395 For calcium imaging
CaCl2 Fisher C614-500 For calcium imaging
MgCl2 VWR 97061-352 For calcium imaging
glucose sigma G7528-250g For calcium imaging
HEPES sigma H4034-500g For calcium imaging
Fura-2 AM Life Technologies F1221 For calcium imaging
Fluronic F-127 Sigma P2443-250g For calcium imaging
Nifedipine Sigma N7634-1G For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM
Isoproterenol sigma I6504-1g For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope 3i For calcium imaging
ethanol Decon Laboratories 2801
bleach Clorox
50 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 227261
15 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 188271
15 cm cell culture dishes Falcon 353025
10 cm cell culture dishes Falcon 353003
60 mm cell culture dishes GREINER BIO-ONE 628160
6 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 657160 
12 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 665180 
24 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 662160 

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Play Video

Cite This Article
Riching, A. S., Zhao, Y., Cao, Y., Londono, P., Xu, H., Song, K. Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (136), e57687, doi:10.3791/57687 (2018).

View Video