Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Ischemische hartziekten is een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten¹. Ongeveer 800.000 Amerikanen ervaring een eerste of terugkerende myocardiaal infarct (MI) per jaar¹. Na MI, de dood van cardiomyocytes (CMs) en cardiale fibrose, gestort door geactiveerde cardiale fibroblasten, afbreuk doen aan hart functie^2,3. Progressie van hartfalen na MI is grotendeels onomkeerbaar te wijten aan de slechte regeneratief vermogen van volwassen CMs^4,5. Terwijl de huidige klinische therapieën vertragen van de progressie van de ziekte en verminderen risico van toekomstige cardiale gebeurtenissen^6,,^7,,^8,9, keren geen therapieën progressie van de ziekte als gevolg van het onvermogen om te regenereren CMs na infarct¹⁰. Nieuwe celtherapieën ontstaan voor de behandeling van patiënten na MI. teleurstellend, klinische proeven leveren van stamcellen naar het hart na MI tot nu toe hebben aangetoond onduidelijk regeneratief mogelijke^{11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18}.

De generatie van mens-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) van fibroblasten door overexpressie van vier transcriptiefactoren, eerst gedemonstreerd door Takahashi & Yamanaka, opende de deur naar nieuwe doorbraken in cel therapie¹⁹. Deze cellen kunnen onderscheiden in alle drie kiem lagen¹⁹, en verscheidene zeer efficiënte methoden voor het opwekken van grote aantallen CMs is eerder gebleken dat^20,21. HiPSC-afgeleide CMs (heupen-CMs) biedt een krachtig platform om te bestuderen van de cardiomyogenesis en kan belangrijke gevolgen hebben voor het hart na letsel herstellen. Echter, heupen-CMs momenteel hindernissen translationeel als gevolg van de bezorgdheid van Teratoom vorming²², en hun onvolwassen aard kan pro-arrhythmogenic²³. Herprogrammering van de fibroblasten in hiPSCs leidde tot interesse in direct herprogrammering fibroblasten in andere celtypes. Ieda et al. aangetoond dat overexpressie van GATA4, Mef2c en Tbx5 (GMT) fibroblasten resulteert in directe herprogrammering aan cardiale afkomst, zij het op een lage efficiëntie²⁴. Herprogrammering van efficiëntie is verbeterd met de toevoeging van Hand2 (GHMT)²⁵. Sinds deze vroege studies, hebben veel publicaties aangetoond dat het veranderen van de herprogrammering factor cocktail met extra transcriptie^{26,27,28,29 factoren}, chromatine modifiers^30,31, microRNAs^32,33, of kleine moleculen³⁴ tot verbeterde leidt herprogrammering efficiëntie en/of rijping van geïnduceerde cardiomyocyte-achtige cellen (iCMs ).

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het genereren van iCMs van muis embryonale fibroblasten (MEFs) met een hoog rendement. Wij eerder toonde aan dat de GHMT cocktail is aanzienlijk verbeterd met de toevoeging van miR-1 en miR-133 (GHMT2m) en is verder verbeterd wanneer pro-fibrotische signaling pathways inclusief transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering of Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK) signaalroutes zijn geremde³⁵. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat ongeveer 60% van de cellen express cardiale troponine T (cTnT), ongeveer 50% express α-actinin en een groot aantal cellen van de afstraffing waarneembaar zo spoedig dag 11 na transductie van herprogrammering factoren en behandeling de TGF-β typ ik receptor remmer A-83-01. Bovendien, deze iCMs express gap junction eiwitten met inbegrip van connexin 43 en spontane contractie en calcium transiënten tentoon te stellen. Dit gemarkeerd verbetering in efficiëntie ten opzichte van eerdere studies herprogrammering toont het potentieel om te regenereren CMs van endogene cel populaties die in het na hartinfarct blijven.