Summary

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

Published: June 03, 2018
doi:

Summary

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.

Abstract

טרנס-התמיינות של תאים סומטיים אחד סוג אחר יש פוטנציאל עצום דגם ולטפל מחלות אנושיות. מחקרים קודמים הראו את העכבר עובריים, עורי, וכן הלב fibroblasts שניתן לתכנת לתאים המושרה cardiomyocyte-כמו תפקודית (לעוצמה מלאה) דרך ביטוי של גורמי שעתוק קרדיוגני כולל GATA4, Hand2, Mef2c, ו Tbx5 גם במבחנה וגם בתוך vivo. עם זאת, מחקרים קודמים אלו הראו יעילות נמוכה יחסית. על מנת לשחזר את תפקוד הלב בעקבות פגיעה, מנגנונים המסדירים התכנות הלב חייב להיות הובהר כדי לשפר את היעילות ואת התבגרותם של לעוצמה מלאה.

אנחנו בעבר הראו כי עיכוב של pro-fibrotic איתות באופן דרמטי מגביר יעילות התיכנות. כאן, אנו מפרטים שיטות כדי להשיג יעילות התיכנות של עד 60%. יתר על כן, נתאר מספר שיטות כולל cytometry זרימה, הדמיה immunofluorescent של סידן הדמיה לכמת יעילות התיכנות, ההבשלה של fibroblasts מחדש. באמצעות פרוטוקול מפורט כאן, ניתן לבצעם מכניסטית מחקרים כדי לקבוע הרגולטורים חיוביים ושליליים של התכנות הלב. מחקרים אלה עשויים לזהות איתות המסלולים זה ניתן לפלח כדי לקדם את יעילות התיכנות, התבגרות, אשר יכול להוביל לטיפולים חדשניים תא לטיפול במחלות לב אנושי.

Introduction

מחלת לב איסכמית הוא הגורם המוביל המוות. ארצות הברית1. כ 800,000 אמריקנים ניסיון קודם או מדלקות אוטם שריר הלב (MI) לכל שנה1. בעקבות MI, מותו של cardiomyocytes (CMs) ואת הלב פיברוזיס, שהופקדו על ידי fibroblasts לב מופעל, לפגום הלב תפקוד2,3. ההתקדמות של אי ספיקת לב לאחר MI בלתי הפיך במידה רבה בשל יכולת ההתחדשות המסכן של CMs למבוגרים4,5 בזמן הנוכחי טיפולים קליניים להאט את התקדמות המחלה, להקטין את הסיכון של אירועי לב בעתיד6,7,8,9, טיפולים לא להפוך את התקדמות המחלה בשל אי להתחדש CMs שלאחר אוטם10. טיפולים חדשניים תא מתגלים לטיפול בחולים בעקבות חוקר אורח מאכזב, הראו ניסויים קליניים אספקת תאי גזע הלב בעקבות MI כה חד משמעיות regenerative פוטנציאלי11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.

הדור של האדם, נגזר המושרה גזע pluripotent (hiPSCs) מ fibroblasts על ידי ביטוי של ארבעה גורמי שעתוק, שהראו מאת טקהאשי & יאמאנקה, פתח את הדלת לפריצות חדש מתא טיפול19. תאים אלה יכולים להתמיין שלוש שכבות הנבט כל19ולאחר מספר שיטות יעילים ביותר ליצירת מספר גדול של CMs בעבר הוכחו20,21. HiPSC-derived CMs (ירכיים-CMs) מציע כלי עוצמתי ללמוד cardiomyogenesis ועל כן ייתכנו השלכות חשובות על תיקון הלב בעקבות פגיעה. עם זאת, ירכיים-CMs כעת להתמודד עם מכשולים translational בשל חששות של היווצרות טרטומה22, טבעם לא בוגר יכול להיות פרו-arrhythmogenic23. התכנות fibroblasts לתוך hiPSCs עוררה עניין ישירות התכנות fibroblasts לתוך סוגי תאים אחרים. . Ieda et al. הפגינו זה ביטוי של GATA4, Mef2c ו- Tbx5 (GMT) בתוצאות fibroblasts ב התכנות ישירה אל הלב, שושלת היוחסין, אם כי-יעילות נמוכה24. התכנות יעילות היה משופר עם התוספת של Hand2 (GHMT)25. מאז אלה מחקרים מוקדם, פרסומים רבים הראו כי שינוי קוקטייל גורם התיכנות עם שעתוק נוספים הגורמים26,27,28,29, כרומטין מכפילי30,31,32,מיקרו Rna33או מולקולות קטנות34 מוביל לשיפור התכנות יעילות ו/או ההבשלה של cardiomyocyte דמוי המושרה תאים (לעוצמה מלאה ).

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי ליצור לעוצמה מלאה מתוך העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) עם יעילות גבוהה. בעבר הראינו כי GHMT קוקטייל משתפרת בצורה משמעותית עם התוספת של מיר-1 ומיר-133 (GHMT2m), חל שיפור נוסף כאשר pro-fibrotic איתות המסלולים כולל הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β) איתות או הקשורים רו פרוטאין קינאז (רוק) איתות המסלולים הם עכבות35. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מראים כי כ- 60% של תאים אקספרס טרופונין לב T (cTnT), כ- 50% אקספרס α-actinin, מספר גבוה של תאי מכות יכול להיות שנצפו מוקדם ככל 11 יום לאחר התמרה חושית של התכנות גורמים וטיפול עם TGF-β מסוג מעכבי הקולטן A-83-01. יתר על כן, אלה לעוצמה מלאה אקספרס gap junction חלבונים כולל connexin 43 ולהציג שנחשולי סידן להתכווצות ספונטנית. השתפרות ב התכנות יעילות לעומת מחקרים מוקדמים יותר מדגים את היכולת להתחדש CMs של אוכלוסיות תא אנדוגני תישאר הלב לאחר אוטם.

Protocol

כל הניסויים הדורשים חיות אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בקמפוס UC דנבר Anschutz רפואית. 1. בידוד של MEFs לרכוש עכברים בהריון C57BL/6-E13. הספינה בין לילה. המתת חסד האמא לפי פרוטוקולים IACUC שאושרו (לשעבר: ~1.3 L/min CO2 להופעת חיה מתה ואחריו נקע בצוואר הרחם)</…

Representative Results

באמצעות האסטרטגיה התיכנות המתוארים לעיל, איור 1B, יצרנו לעוצמה מלאה עם-70% של תאים לבטא T טרופונין הלב, כ- 55% של תאים לבטא לב α-actinin, לכמת על ידי cytometry זרימה-יום 9 בעקבות התמרה חושית של GHMT2m (איור 2 א ו- B). בנוסף, הרוב המכריע של תאים אקספרס טי …

Discussion

המחקר הנוכחי מתווה אסטרטגיה יעילות גבוהה לתכנת fibroblasts ישירות לתוך פונקציונלי לעוצמה מלאה באמצעות מסירת GHMT2m התכנות גורמים בשילוב עם דיכוי של pro-fibrotic איתות המסלולים. שימוש cytometry זרימה, הדמיה immunofluorescent, סידן הדמיה, ומכים תא ספירת, אנו מראים את רוב התאים ב פרוטוקול זה עוברים התכנות מוצלחת ולאמץ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרנות מתוכנית של קרן Boettcher וארינג ווב ביו מחקר, מענק פיתוח מדען איגוד הלב האמריקאי (13SDG17400031), אוניברסיטת קולורדו מחלקת הרפואה בראשית הקריירה יוצאת מן הכלל תוכנית מלומד, אוניברסיטת קולורדו חלוקה של קרדיולוגיה בארלו Nyle הקדש, ואת NIH R01HL133230 (ל K.S). A.S.R נתמכה על ידי NIH/NCATS קולורדו CTSA גרנט מספר TL1TR001081, מלגת הדוקטורט מראש מן האיחוד אוניברסיטת קולורדו עבור מחקר פיברוזיס & תרגום (CFReT). מחקר זה גם נתמך על ידי המענק תמיכה מרכז הסרטן (P30CA046934), המענק ליבות (P30AR057212) לחקר מחלות העור, הליבה Cytometry זרימה בקמפוס אוניברסיטת קולורדו Anschutz רפואית.

Materials

C57BL/6 Mice Charles River's Laboratory 027 For MEF isolation
Platinum E (PE) Cells Cell Biolabs, INC RV-101 For retrovirus production
DMEM High Glucose Gibco SH30022.FS Component of iCM, PE, and Growth media
Medium 199 Life Technologies 11150-059 Component of iCM media
Fetal Bovine Serum Gemini 100106 Component of iCM, PE, and Growth media
Donor Horse Serum Gemini 100508 500 Component of iCM media
MEM Essential Amino Acids, 50X Life Technologies 11130051 Component of iCM media
Sodium Pyruvate Solution, 100X Life Technologies 11360070 Component of iCM media and for calcium imaging
MEM Non-Essential Amino Acids, 100X Life Technologies 11140050 Component of iCM media
MEM Vitamin Solution, 100X Life Technologies 11120-052 Component of iCM media
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 41400045 Component of iCM media
B27 Gibco 17504-044 Component of iCM media
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of iCM, PE, and Growth media
GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) Gibco 35050-061 Component of iCM, PE, and Growth media
Blasticidin-HCl Life Technologies A11139-03 Component of PE media
Puromycin dihydrochloride Life Technologies A11138-03 Component of PE media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200-056 For detaching cells from culture dishes
A-83-01 R&D Systems – Tocris 2939/10 Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM
DMSO Thermo Scientific 85190 For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium
SureCoat Cellutron SC-9035 For coating dishes to plate MEFs
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2692 Transfection Reagent
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 11058-021 Transfection Reagent
pBabe-X Myc-GATA4 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Hand2 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Mef2c Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X Myc-Tbx5 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-1 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X miR-133 Plasmid containing reprogramming factor
pBabe-X GFP Plasmid containing reprogramming factor
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma H9268-5G For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL
Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) Nalgene  569-0020  For filtering media
Syringes Bd Vacutainer Labware  309654 For viral filtration
0.45 µm Filters Celltreat 229749 For viral filtration
70 µm cell strainers Falcon  352350 For MEF isolation and Flow Cytometry
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry
perm/wash buffer  BD 554723 For washing cells for flow cytometry
DPBS 1X Gibco 14190-250 For washing cells
Bovine Serum Albumin VWR 0332-100g For flow cytometry and calcium imaging
Goat Serum Sigma  G9023 For blocking cells for Flow Cytometry
Donkey Serum Sigma D9663-10mg For blocking cells for Flow Cytometry
Mouse Troponin T Thermo Scientific ms-295-p 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Mouse α-actinin Sigma A7811L 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry
Rabbit Connexin 43 Sigma  C6219 1:400 IF
Rabbit Troponin I PhosphoSolutions 2010-TNI 1:400 IF
Hoechst Life Technologies 62249 1:10000 IF
Alexa 488, rabbit Life Technologies A-11034 1:800 IF
Alexa 555, mouse Life Technologies A-21422 1:800 IF
Alexa 647, mouse Life Technologies A-31571 1:200 Flow Cytometry
27-color ZE5 Flow Cytometer  Bio-RAD For FACS
Paraformaldehyde sigma P6148-500mg For fixing cells for IF
Triton X-100 Promega H5142 For permeabilization of cells for IF
EVOS™ FL Color Imaging System Thermo Scientific AMEFC4300 For IF
NaCl RPI S23020-5000 For calcium imaging
KCl VWR 395 For calcium imaging
CaCl2 Fisher C614-500 For calcium imaging
MgCl2 VWR 97061-352 For calcium imaging
glucose sigma G7528-250g For calcium imaging
HEPES sigma H4034-500g For calcium imaging
Fura-2 AM Life Technologies F1221 For calcium imaging
Fluronic F-127 Sigma P2443-250g For calcium imaging
Nifedipine Sigma N7634-1G For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM
Isoproterenol sigma I6504-1g For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM
Marianas Spinning Disk Confocal microscope 3i For calcium imaging
ethanol Decon Laboratories 2801
bleach Clorox
50 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 227261
15 mL conical tubes GREINER BIO-ONE 188271
15 cm cell culture dishes Falcon 353025
10 cm cell culture dishes Falcon 353003
60 mm cell culture dishes GREINER BIO-ONE 628160
6 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 657160 
12 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 665180 
24 well cell culture plates GREINER BIO-ONE 662160 

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
  3. Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D. Cardiac muscle regeneration: lessons from development. Genes & Development. 25 (4), 299-309 (2011).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Nabel, E. G., Braunwald, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. N Engl J Med. 366 (1), 54-63 (2012).
  7. Packer, M., et al. Effect of carvedilol on the morbidity of patients with severe chronic heart failure: results of the carvedilol prospective randomized cumulative survival (COPERNICUS) study. Circulation. 106 (17), 2194-2199 (2002).
  8. The CAPRICORN Investigators. Effect of carvedilol on outcome after myocardial infarction in patients with left-ventricular dysfunction: the CAPRICORN randomized trial. The Lancet. 357 (9266), 1385-1390 (2001).
  9. Marangou, J., Paul, V. Current attitudes on cardiac devices in heart failure: a review. Clin Ther. 37 (10), 2206-2214 (2015).
  10. Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Bio. 14 (8), 529-541 (2013).
  11. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomized controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  12. Schachinger, V., et al. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1210-1221 (2006).
  13. Huikuri, H. V., et al. Effects of intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells on left ventricular function, arrhythmia risk profile, and restenosis after thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 29 (22), 2723-2732 (2008).
  14. Janssens, S., et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 367 (9505), 113-121 (2006).
  15. Lunde, K., et al. Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction. N. Engl. J. Med. 355 (12), 1199-1209 (2006).
  16. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial – a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart J. 152 (3), 434-441 (2006).
  17. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  18. Karantalis, V., et al. Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial. Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).
  19. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  20. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  21. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: A source of cardiac regeneration. J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  23. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
  24. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 357-386 (2010).
  25. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  26. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).
  27. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  28. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  29. Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFβ signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).
  30. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  31. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).
  32. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function. Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).
  33. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).
  34. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 1-15 (2015).
  36. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).
  37. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  38. Zhou, H., et al. ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Dev. 31, 1770-1783 (2017).
  39. Mohamed, T. M., et al. Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming. Circulation. 135, 978-995 (2017).
  40. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  41. Mathison, M., et al. In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration. J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).

Play Video

Cite This Article
Riching, A. S., Zhao, Y., Cao, Y., Londono, P., Xu, H., Song, K. Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (136), e57687, doi:10.3791/57687 (2018).

View Video