Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung
Summary
Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.
Abstract
Für die Bewertung der neuen Therapeutikum für Immuntherapie oder Impfung ist Analyse der immun-Zell-Aktivierung in lymphatischen Geweben unerlässlich. Hier untersuchten wir immunologische Effekte von einem neuartigen Lipid-DNA immunstimulierende Nanoparticle Form aus verschiedenen Verwaltung Routen in der Maus: oral, intranasale, subkutane, Straßenräuber, intraperitoneale und intravenöse. Diese Injektionen direkt beeinflussen, die Immunantwort und Ernte lymphatische Geweben und Analyse von dendritischen Zellen (DC) Aktivierung in den Geweben sind wichtige Teile dieser Bewertungen. Die Gewinnung von mediastinalen Lymphknoten (mLNs) ist wichtig aber recht komplex aufgrund der Größe und Lage dieses Organs. Eine schrittweise Vorgehensweise für die Ernte der inguinalen Lymphknoten (iLN), mLN und Milz und Analyse von DC-Aktivierung durch Durchflusszytometrie wird beschrieben.
Introduction
Fortschritte in der Immunologie und Nanomaterialien haben zu einer Fülle von potenziellen neuen Therapiestrategien für Anwendungen in der Biomedizin, einschließlich Drug-Delivery und Immunstimulierung geführt. Optimierung der Verwaltung Route ist ein wichtiger Aspekt betrifft die Wirksamkeit von immunstimulierenden Agenten. Ein immunstimulierenden Nanopartikel (INP) bestehend aus DNA ist eine neu entwickelte Nano-immun adjuvante selbst durch Microphase Trennung aufgrund der AMPHIPHILE Struktur der Lipid-DNA1montiert. Daher, Protokolle für INP mit Verwaltung des materiellen1 in Vivo über verschiedene Routen und drei Verfahren für die Ernte geeignete Gewebe wie die inguinalen Lymphknoten (iLN), Mediastinale LN (mLN) und Milz, beschrieben. Schließlich wurden diese Gewebe für die Aktivierung von dendritischen Zellen (DC), der mächtigsten Antigen-präsentierenden Zellen im Immunsystem analysiert. Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, für die Bewertung der Antigene, Antikörper oder andere immun Adjuvantien-2.
Wir testeten die INP-Formulierung, weil es ein Mittel ist, das großes Versprechen gezeigt hat. INP ist ein Toll-Like-Rezeptor 9 (TLR9) adjuvante Material, die Nukleinsäuren, für die Beurteilung der Immunstimulierung Wirksamkeit erforderlich enthält ist, um verschiedene Einspritzung Methoden3zu testen. In diesem Zusammenhang ist die Stimulation des DCs einen potenten Endpunkt für in Vivo Evaluation. Nachdem Antigen oder immunstimulierenden Moleküle von DCs im peripheren Gewebe oder Blut phagozytiertes sind, Wandern diese Zellen in lymphatischen Organen wie Milz und LNs4,5. So wurde DC-Aktivierung in der Milz, iLN und mLN der injizierten Tiere analysiert. Richtig ernten dieser Gewebe ist daher auch entscheidend für die Beurteilung der Immunantwort auf eine neuartige adjuvante oder Krankheitserreger5. Solche Gewebe Ernte ist auch wichtig für die Entwicklung einer neuartigen immunologischen Methodik als Krebstherapie. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Effizienz von anderen Drogen, wie z. B. Anti-Human Immunodeficiency Virus Therapeutika6zu überprüfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viele Fortschritte in der Nanotechnologie und Immunologie wurden durch therapeutische Forschung Drug-Delivery und Immunstimulierung erzielt. Sorgfältige Auswahl der Injektion Methode ist bekanntermaßen wichtig für Immunstimulierung, die lag der Schwerpunkt der vorliegenden Studie.
Verschiedenen Injektion Routen wurden ausgewertet, für ein natürlich ungiftig und biologisch abbaubar DNA-basierte Material, INP (immunstimulierenden Nanopartikel), um festzustellen, welchen Weg das beste Ergebn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch kreative Materialien-Discovery-Programm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT und Zukunft planen (NRF-2017M3D1A1039421) und Marine Biotechnologie-Programm finanziert die Ministerium der Ozeane und Fischerei, Republik Korea und einen Zuschuss (20150220).
Materials
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe – | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | – | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | – | FACS analysis |
References
- Park, H. . Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- . . General anesthesia of mice and rats. , (2016).
- . . Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
