Summary

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

Published: October 07, 2018
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Abstract

Seit fast 40 Jahren stellt man DNA-Injektion der standard Methode zur Erzeugung transgener Mäuse mit zufälligen Integration der Transgene. Solch ein Routineverfahren ist weit verbreitet in der ganzen Welt genutzt und seine wichtigste Einschränkung befindet sich in der schlechten Wirksamkeit von Transgen-Integration, was zu einer geringen Ausbeute von Gründer Tiere. Nur wenige Prozent der Tiere geboren nach der Implantation der befruchteten Eizellen injiziert haben das Transgen integriert. Im Gegensatz dazu Lentivirale Vektoren sind leistungsfähige Werkzeuge für integrative Gentransfer und deren Einsatz zur befruchtete Eizellen transduzieren ermöglicht hocheffiziente Produktion des Gründers transgener Mäuse mit einem Durchschnittsertrag über 70 %. Darüber hinaus jede Maus Belastung kann verwendet werden, um Transgene Tiere zu erzeugen und die Penetranz des Transgens Ausdruck ist extrem hoch, über 80 % mit Lentivirale vermittelten Transgenese im Vergleich zu DNA-Mikroinjektion. Die Größe des DNA-Fragments, die Ladung durch den Lentivirale Vektor sein können beschränkt sich auf 10 kb und die große Einschränkung dieser Methode darstellt. Mit einer einfachen und leicht durchzuführen Injektion unter die Zona Pellucida der befruchteten Eizellen, sind mehr als 50 Gründer Tiere in einer einzigen Sitzung der Mikroinjektion herstellbar. Diese Methode eignet sich sehr direkt in Gründer Tiere, schnellen Gewinn und Verlust von Funktionsstudien oder Bildschirm genomische DNA-Regionen für ihre Fähigkeit zur Kontrolle und Regulierung Gen Ausdruck in Vivodurchführen.

Introduction

Die Pionierarbeit von Gordon Et Al. 1980 zeigte, dass die Plasmid DNA-Injektion in die männliche Vorkerne von befruchteten Eizellen nach der Implantation bei pseudopregnant Mäusen die Erzeugung transgener Tiere hervorbringen kann, die integriert die Plasmid DNA-1. Die Demonstration, dass transgene Säugetiere generiert werden können hatte einen enormen Einfluss auf global Life-Sciences, öffnet den Weg zu neuen Feldern der Forschung sowohl für Grundlagenwissenschaften und Translationale Biomedizin. In den vergangenen vier Jahrzehnten ist DNA Mikroinjektion Routinepraxis geworden. Obwohl eine enorme Anzahl von transgenen Mäuse hergestellt wurden, die standard-Methode ist nicht voll einsatzfähig für alle Maus-Stämmen und erfordert zeitaufwendig Rückkreuzungen2,3. Seine Anwendung auf andere Arten bleibt herausfordernd4 und der Gesamtertrag der Transgen-Integration beschränkt sich auf wenige Prozentsatz der geborenen Tiere5. Darüber hinaus stellt die Wirksamkeit der Transgen-Integration den limitierenden Faktor, der die Armen Gesamtausbeute von man DNA-Injektion erklärt. In dieser Hinsicht integrative virale Vektoren sind die effizientesten Tools zum Fracht und transgene zu integrieren und so könnten neue Mittel, um deutlich erhöhen Integration Ausbeute, die einzige Einschränkung ist, dass die Transgen-Größe, die6 10 kb nicht überschreiten darf .

Mit dem Briefumschlag-Protein von vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) Pseudo-typisierte Lentivirale Vektoren sind pantropic und hoch integrative gen-Transfer-Tools und können verwendet werden, um die befruchteten Eizellen7transduzieren. Die Zona Pellucida rund um die Eizellen ist eine natürliche Virus Barrier und damit Transduktion mit Lentivirale Vektoren können übergeben werden muss. Transgene Tiere wurden durch 3D-Steuerung befruchtete Eizellen nach dem Mikro-Bohren oder Entfernen der Zona Pellucida8,9generiert. Injektion unter die Zona Pellucida in den Perivitelline Raum scheint jedoch die einfachste Methode, um die befruchteten Eier wie anfangs beschrieben von Lois und Kollegen7transduzieren.

Die Perivitelline Injektion von Lentivirale Vektoren kann hohe Erträge bei der Herstellung transgener Tiere, die mehr als 70 % der geborenen Tiere sind. Dieser Ertrag ist mehr als 10-fach höher als die beste Ausbeute, die mit standard Vorkerne DNA Injektion7,10,11erreicht werden kann. In diesem Zusammenhang wird eine Einzelsitzung der Injektionen mindestens 50 transgenen Gründer (F0) generieren. Die große Zahl der Gründer ist daher kompatibel mit Phänotypisierung des Effekts Transgens direkt auf F0 Mäuse ohne die Notwendigkeit zu erzeugen transgene Mauslinien durchgeführt. Dieser Vorteil ermöglicht schnelle Screening des Effekts Transgens und ist speziell auf in Vivo -Gewinn und Verlust der Funktionsstudien innerhalb von Wochen durchführen. Darüber hinaus können regulatorische DNA-Elemente auch rasch untersucht werden, um Karte Enhancer und DNA-Motive, die durch Transkription Faktoren11,12gebunden. Transgene Integration mit man Injektionen in der Regel als mehrere Kopien in einen einzigartigen Ort. Mit Lentivirale Vektoren kommt Integration in mehrere Loci als eine einzelne Kopie pro Locus10,13. Daher ist die Vielzahl der integrierten Loci am ehesten, die sehr hohe Expression Penetranz beobachtet in transgenen Gründer, wodurch das neue generierte Modell robuster zugeordnet.

Wichtig ist, wenn man Injektion von DNA, ist Visualisierung der Vorkerne während des Verfahrens zwingend notwendig. Diese technische Einschränkung verhindert die Verwendung von befruchteten Eizellen, die aus einer Vielzahl von Maus-Stämmen. Daher die Produktion eines transgenen Modells in einem bestimmten Stamm für die Vorkerne sind unsichtbar die Produktion von Tieren in einem freizügigen Stamm erfordert, gefolgt von mindestens 10 aufeinander folgenden Rückkreuzungen das Transgen in der gewünschten Maus übertragen Zuchtlinie Mit der Lentivirale Vektor-Injektionen Perivitelline Raum ist immer sichtbar und die Injektion erfordert keine hochspezifische Fähigkeiten. Als Beispiel wurden NOD/SCID transgenen Mäusen, die nicht geeignet für die Vorkerne Injektion sind mit dem viralen Vektoren Injektionen14gewonnen.

Hier ist ein umfassendes Protokoll präsentiert, um einfache Herstellung von transgenen Mäusen mit Lentivirale Vektor-Injektionen in den Perivitelline Raum des Embryos Bühne einer Zelle zu ermöglichen. Transgene Ausdruck gesteuert entweder mit allgegenwärtigen oder Zelle spezifische Promotoren wird ausführlich beschrieben.

PTrip ΔU3 Lentivirale Rückgrat wurde in dieser Studie15verwendet. Dieser Vektor kann für die Herstellung von Replikation defekt Lentivirale Vektoren in denen U3-Sequenz teilweise gelöscht wurde zum Entfernen U3 promotoraktivität und generieren eine Self inactivating Vektor (SIN)16. Lentivirale Vektor Bestände wurden durch Transiente Transfektion von Zellen der HEK-293T mit dem p8.91 Kapselung Plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G, Codierung die vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) Glykoprotein-G17und pTRIP ΔU3 produziert. rekombinanten Vektor. Die produktionsfeinplanung Verfahren wird als ergänzende Methoden bereitgestellt.

Produktion von hohen Titer Lentivirale Vektor Aktien erfolgt unter Biosafety Level II Bedingungen (BSL-2). Dies gilt auch für die meisten transgene außer Onkogene, die in BSL-3 hergestellt werden. Daher ist die Produktion in BSL-2 Bedingungen in den meisten Fällen ausreichend. Darüber hinaus werden der Einsatz und die Produktion in der Regel für die meisten nationalen Regulierungsbehörden Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) getrennt. Begrenzte Mengen an Replikation inkompetent SIN Lentivirale Vektoren (unter 2 µg Protein p24 Kapsid) können unter BSL-1 Bedingungen wie die französischen GVO-Agentur in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Union beschrieben verwendet werden.

Protocol

Alle Prozeduren, die tierische Arbeit beinhalten ethische Genehmigung erhalten haben und sind durch das französische Ministerium für Forschung und Bildung unter der Nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 und 05311.02 autorisiert worden. Die ICM Tierhaus PHENOPARC hat durch das französische Landwirtschaftsministerium unter der Akkreditierungsnummer B75 akkreditiert 13 19. Das gesamte Protokoll erfordert Durchführung jedes Verfahren innerhalb eines präzisen Zeitrahmens, das in zusammengefasst werden in <strong class…

Representative Results

Transgene Tiere wurden mit dem hier vorgestellten Protokoll generiert. Vertreter führt beide allgegenwärtig und Zelle Art spezifische Transgene Ausdruck dargestellt. Konstitutive Expression von transgenen Allgegenwärtige Promotoren sind Grundlagenforschung Werkzeuge transgene in eine nachhaltige und effiziente Weise zum Ausdruck zu bringen. Diese Pr…

Discussion

Die Perivitelline Injektion von Lentivirale Vektoren in befruchteten Eizellen, die hier beschriebenen führte zu die Herstellung von transgenen Embryonen, die mehr als 70 % der transgenen Embryonen bezogen auf die Gesamtzahl der gesammelten Embryonen ergab. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten und beispielhaft für die Besonderheit des Verfahrens2,7,10,11,<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Magali Dumont und Rolando Meloni für kritische Lektüre des Manuskripts und iVector und Phenoparc ICM Kerne für technische Unterstützung bei Lentivirale Vektor Produktion und Tier bzw. Gehäuse. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Institut Hospitalo Universitaire de Neurowissenschaften Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.r. erhielt die Mittel für die Association de Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) und eine gemeinsame JDRF / INSERM gewähren.

Materials

PMSG 50UI Sigma G4527
hCG 5000UI Sigma CG5-1VL
NaCl Sigma 7982
100 mm petri dish Dutsher 353003
4 wells Nunc dish Dutsher 56469 IVF dish
M2 medium Sigma M7167
M16 medium Sigma M7292
0,22 µm Syringe filter Dutsher 146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg Sigma H4272 mouse embryo tested
Insulin serynge VWR 613-3867 Terumo Myjector
Curved forceps Moria 2183
Curved scissors Moria MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries Harvard apparatus GC 100-10
Horizontal micropipette puller Narishige PN-30
Microforge Narishige MF-900
Inverted microscope Nikon Transferman NK2 5188 Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator Eppendorf Celltram air
Controler of holding pipet Eppendorf Femtojet
Mineral oil Sigma M8410 mouse embryo tested
Microinjector Eppendorf Femtojet Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps Moria MC 40
vannas micro scissors Moria 9600
Isoflurane centravet ISO005 ISO-VET 100% 250ml
ocrygel centravet OCR002
Povidone iodure centravet VET001 vetedine 120ml
Buprenorphine centravet BUP002 Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl Sigma T5941 Trizma hydrochloride
EDTA Sigma E9884
SDS Sigma 436143
NaCl Sigma S7653 powder
proteinase K Sigma P2308 
oneTaq kit NEB M0480L
Primers Eurogentec
Strip of 8 PCR tube 4titude 4ti-0781
96 well thermal cycler Applied Biosystems 4375786 Veriti
Genomic DNA mini kit invitrogen K1820-02
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000C 
qPCR Master mix Roche 4887352001 SYBR Green 
Multiwell plate 384 Roche 5217555001
qPCR instrument 384 well Roche 5015243001 LightCycler 480

References

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Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (140), e57609, doi:10.3791/57609 (2018).

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