لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز التكامل التحوير وإنتاج مؤسس الفئران المحورة وراثيا بكفاءة عالية بحقنه بسيطة ناقل لينتيفيرال في الفضاء بيريفيتيليني البويضات المخصبة.
Abstract
لما يقرب من 40 عاماً، يمثل حقن الحمض النووي برونوكلير الطريقة القياسية لتوليد الفئران المحورة وراثيا مع التكامل العشوائي المتسلسلات. هذا إجراء روتيني ويستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم، وأن العقبة الرئيسية تكمن في ضعف فعالية التكامل التحوير، أدى إلى انخفاض عائد من الحيوانات مؤسس. أدمجت في المائة عدد قليل فقط من ولد بعد زرع بويضات مخصبة حقن الحيوانات التحوير. على النقيض من ذلك، الناقلة لينتيفيرال أدوات قوية لنقل الجينات التكاملية واستعمالها ترانسدوسي بويضات مخصبة يسمح الإنتاج ذات كفاءة عالية لمؤسس الفئران المعدلة وراثيا وبمتوسط إنتاج أعلى من 70%. وعلاوة على ذلك، أي سلالة الماوس يمكن استخدامها لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا و penetrance التعبير التحوير مرتفعة للغاية، فوق 80% مع لينتيفيرال ترانسجينيسيس وساطة مقارنة microinjection الحمض النووي. حجم الجزء الحمض النووي التي يمكن أن تكون البضائع المتجهة لينتيفيرال يقتصر على 10 كيلو بايت ويمثل القيد الرئيسي لهذا الأسلوب. استخدام بسيطة وسهلة لإجراء الحقن تحت zona pellucida من بويضات مخصبة، يمكن أن تنتج أكثر من 50 مؤسس الحيوانات في جلسة واحدة من microinjection. هذا أسلوب تكييف عالية لأداء، مباشرة في الحيوانات مؤسس والربح السريع والخسارة للدراسات الدالة أو إلى مناطق الحمض النووي الجينومي الشاشة لقدرتها على ضبط وتنظيم الجينات التعبير في فيفو.
Introduction
العمل الريادي جوردون et al. في عام 1980 وأظهرت أن حقن الحمض النووي بلازميد في الذكور برونوكلي من بويضات مخصبة بعد زرع في الفئران بسيودوبريجنانت، يمكن أن تسفر عن إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي تدمج بلازميد الحمض النووي1. المظاهرة أن الثدييات المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد كان له تأثير هائل على علوم الحياة العالمية، وفتح الطريق إلى حقول جديدة من البحث سواء بالنسبة للعلوم الأساسية والعلوم الطبية الحيوية متعدية الجنسيات. في العقود الأربعة الماضية، أصبح الحمض النووي microinjection ممارسة روتينية. على الرغم من أن تم إنتاج عدد هائل من الفئران المحورة وراثيا، غير قابلة للاستخدام الكامل لجميع سلالات الماوس الطريقة القياسية ويتطلب وقتاً طويلاً باككروسيس2،3. تطبيقه على الأنواع الأخرى ويظل التحدي4 والعائد التكامل التحوير عموما تقتصر على نسبة قليلة من الحيوانات ولدت5. وباﻹضافة إلى ذلك، فعالية التكامل التحوير يمثل عاملاً يحد من يشرح العائد الإجمالي الفقراء pronuclear حقن الحمض النووي. وفي هذا الصدد، النواقل الفيروسية التكاملية هي الأدوات الأكثر فعالية لنقل البضائع وإدماج المتسلسلات وبالتالي يمكن أن توفر وسائل جديدة زيادة غلتها التكامل والقيد الوحيد هو أن الحجم التحوير الذي لا يمكن أن يتجاوز 10 كيلو بايت6 .
لينتيفيرال ناقلات الزائفة المكتوبة مع البروتين يأت من فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة) هي أدوات نقل الجينات بانتروبيك وتكاملية عالية ويمكن استخدامها ترانسدوسي بويضات مخصبة7. Zona pellucida المحيطة بويضات حاجزاً فيروس طبيعي ويحتاج لتمريرها إلى السماح بتوصيل مع ناقلات لينتيفيرال. الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها بواسطة بويضات مخصبة ترانسدوسينج بعد الحفر الصغيرة أو إزالتها من8، zona pellucida9. ومع ذلك، يبدو الحقن تحت zona pellucida في الفضاء بيريفيتيليني أن أبسط طريقة للبيض المخصب كما هو موضح في البداية ب لويس والزملاء7ترانسدوسي.
حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات يسمح الغلات العالية في إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي أعلى من 70% حيوانات ولدت. هذا العائد ما يزيد على 10 إضعاف أعلى من عائد أفضل ما يمكن تحقيقه باستخدام معيار pronuclei الحمض النووي حقن7،10،11. وفي هذا السياق، سينشئ جلسة واحدة من حقن مؤسسي المحورة وراثيا على الأقل 50 (F0). ، ولذلك العدد الكبير من مؤسسي متوافق مع phenotyping أثر التحوير مباشرة أجريت على الفئران F0 دون الحاجة إلى إنشاء خطوط الماوس المحورة وراثيا. هذه الميزة تسمح للفحص السريع لتأثير التحوير وتكييف خصيصا لأداء في فيفو المكسب والخسارة للدراسات وظيفة في غضون أسابيع. وباﻹضافة إلى ذلك، العناصر التنظيمية الحمض النووي يمكن أيضا سرعة فحص لخريطة معززات وزخارف الحمض النووي ملزمة بالنسخ العوامل11،12. مع حقن برونوكليار، دمج المتسلسلات عادة نسخ متعددة كما في موضع فريد من نوعه. مع نواقل لينتيفيرال، يحدث التكامل في مواضع متعددة كنسخة واحدة كل10،موضع13. ولذلك، تعدد المكاني المتكامل الأكثر احتمالاً المرتبطة penetrance التعبير عالية جداً في مؤسسي المحورة وراثيا، مما يجعل هذا النموذج التي تم إنشاؤها جديدة أكثر قوة.
الأهم من ذلك، عند استخدام حقن برونوكليار للحمض النووي، التصور من برونوكلي أثناء الإجراء مطلوب على الإطلاق. يمنع هذا التقييد التقنية استخدام بويضات مخصبة مصدرها مجموعة كبيرة ومتنوعة من سلالات الماوس. ولذلك، إنتاج نموذج المعدلة وراثيا في محدد السلالة التي برونوكلي غير مرئية يتطلب إنتاج الحيوانات في سلالة متساهلة تليها على الأقل 10 باككروسيس المتعاقبة لنقل التحوير في الماوس المطلوبة سلالة. مع حقن متجه لينتيفيرال، بيريفيتيليني الفضاء دائماً مرئياً والحقن لا تتطلب مهارات محددة للغاية. على سبيل مثال، تم الحصول على موافقة/مشمولان الفئران المعدلة وراثيا التي لا تكون مناسبة لحقن برونوكلي مع حقن النواقل الفيروسية14.
هنا، يقدم بروتوكول شامل للسماح بإنتاج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الحقن لينتيفيرال المتجهات في الفضاء بيريفيتيليني جنين المرحلة خلية واحدة بسيطة. التعبير التحوير يسيطر مع أما في كل مكان أو المروجين الخلية المحددة يتم وصف بالتفصيل.
واستخدمت في هذه الدراسة15العمود الفقري لينتيفيرال ΔU3 بتريب. يسمح هذا متجه لإنتاج النسخ المتماثل ناقلات لينتيفيرال المعيبة التي تسلسل U3 جزئيا وحذفت لإزالة نشاط المروج U3 وتوليد متجه (سين) الذاتي إيناكتيفاتينج16. الأسهم ناقلات لينتيفيرال تم إنتاجها بواسطة عابر تعداء الخلايا HEK-293T مع p8.91 تغليف بلازميد (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6، فكمف-ز ترميز بروتين سكري-ز (منظمة) فيروس التهاب الفم الحويصلي17، و ΔU3 بتريب ناقل المؤتلف. ويرد الإجراء إنتاج مفصلة كأساليب تكميلية.
إنتاج مخزون متجه لينتيفيرال عيار عالية تتم تحت ظروف السلامة الأحيائية المستوى الثاني (BSL-2). وهذا صحيح بالنسبة لمعظم المتسلسلات باستثناء المسرطنة التي يمكن إنتاجها في BSL-3. ولذلك، يكفي بالإنتاج في ظروف BSL-2 لمعظم الحالات. وبالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون قطع الاستخدام والإنتاج لمعظم الوكالات التنظيمية الوطنية التي تتعامل مع الكائنات المحورة وراثيا (جينياً). ويمكن استخدام كميات محدودة من النسخ المتماثل غير كفء الخطيئة ناقلات لينتيفيرال (أقل من 2 ميكروغرام من البروتين قفيصه p24) تحت ظروف BSL-1 كما هو موضح بالوكالة “الفرنسية المعدلة وراثيا” بالاتفاق مع توصيات الاتحاد الأوروبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات في بويضات مخصبة الموصوفة هنا أدت إلى إنتاج أجنة معدلة وراثيا التي أسفرت عن أكثر من 70% أجنة المعدلة وراثيا بالقياس إلى مجموع عدد الأجنة التي تم جمعها. هذه النتيجة تتسق مع التقارير السابقة وتجسد خصوصية الإجراء2،،من7<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر دومون مجلي وميلوني رولاندو لقراءة نقدية من المخطوطة وإيفيكتور و “فينوبارك ICM النوى” للمساعدة التقنية في إنتاج ناقلات لينتيفيرال والحيوان السكن على التوالي. هذا العمل كان يدعمه دي ترانسلاتيونليس المعهد الجامعي هوسبيتالو “دي علوم الأعصاب” باريس، رامي-A-ICM، يشرف دعفينير ANR-10-إيايهو-06. العلاقات العامة وتلقى التمويل للفرنسية Langue de الرابطة من أجل دراسات دو Diabète et des علل Métaboliques (الفيديام) ومن JDRF مشترك/منح INSERM.
Materials
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
