Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس
Summary
والهدف العام لأسلوب التنميط polysome تحليل النشاط متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو مرناس الترنسكربيتوم خلال تخليق البروتين. الأسلوب مهم لدراسات البروتين التوليف تنظيم وتفعيل الترجمة والقمع في الصحة والأمراض البشرية المتعددة.
Abstract
تعبير البروتين المناسبة في الوقت المناسب وفي المبالغ الصحيحة التي هي أساس وظيفة الخلية الطبيعية والبقاء على قيد الحياة في بيئة سريعة التغير. لفترة طويلة، يهيمن عليها البحوث على المستوى النسخي دراسات التعبير الجيني. ومع ذلك، مستويات مستقرة مرناس ترتبط أيضا بإنتاج البروتين، وطواعية مرناس يختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للظروف. في بعض الكائنات، مثل طفيلي الليشمانيا، ينظم التعبير البروتين معظمها على مستوى متعدية الجنسيات. أظهرت الدراسات الأخيرة أن التقلبات ترجمة البروتين يرتبط بالسرطان، والايض والأعصاب وغيرها من الأمراض البشرية. Polysome التنميط وسيلة قوية لدراسة تنظيم ترجمة البروتين. أنها تسمح لقياس حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو دراسة الترجمة على نطاق الجينوم. أساس هذا الأسلوب هو فصل polysomes وريبوسوم، والوحدات الفرعية ومرناس الحرة أثناء الطرد المركزي من هيولى من خلال تدرج سكروز. نقدم هنا، بوليسومي عالمي تنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة–طفيل ليشمانيا كبيرة، استزراع الخلايا البشرية والأنسجة الحيوانية. ليشمانيا الخلايا تنمو بحرية في التعليق وتنمو الخلايا البشرية المستزرعة في أحادي الطبقة ملتصقة، بينما يمثل الخصية الماوس عينة أنسجة حيوانية. وهكذا، التقنية تتكيف مع كل مصدر من هذه المصادر. ويتضمن البروتوكول المتعلق بتحليل الكسور بوليسومال الكشف عن مستويات مرناً الفردية التي RT-قبكر، البروتينات لطخة غربية والتحليل للكشف الريباسي بالتفريد. الأسلوب يمكن تمديد دراسة رابطة مرناس مع الريبوسوم على مستوى الترنسكربيتوم بتسلسل الحمض النووي الريبي العميق وتحليل البروتينات المرتبطة الريبوسوم بالتحليل الطيفي الشامل للكسور. الأسلوب يمكن تعديلها بسهولة للنماذج البيولوجية الأخرى.
Introduction
ويسيطر تنظيم التعبير الجيني في الخلايا آليات النسخي وبوسترانسكريبشونال وبوستترانسلاشونال. السلف في تسلسل الحمض النووي الريبي عميقة تسمح دراسة مستويات مرناً مستقرة على نطاق الجينوم بمستوى لم يسبق له مثيل. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن مستوى مرناً حالة ثابتة لا يرتبط دائماً بإنتاج البروتين1،2. مصير نسخة فردية معقدة جداً ويعتمد على عوامل كثيرة مثل المحفزات الداخلية والخارجية، والإجهاد، إلخ. تنظيم التعبير الجيني خلال تخليق البروتين يوفر طبقة أخرى من التعبير التحكم اللازمة لاستجابة سريعة في الظروف المتغيرة. بوليسومي (أو “بوليريبوسومي”) التنميط، والانفصال، والتصور بنشاط ترجمة ريبوسوم، وسيلة قوية لدراسة تنظيم تخليق البروتين. وعلى الرغم من تطبيقاته التجريبية الأولى ظهرت في الستينات3، polysome التنميط حاليا واحدة من التقنيات الأكثر أهمية في البروتين ترجمة الدراسات4. يمكن ترجمة مرناس واحدة من الريبوسوم واحد أو أكثر مما يؤدي إلى تشكيل بوليسومي. يمكن أن توقف المحاضر في ريبوسوم مع سيكلوهيكسيميدي5 ويمكن فصل مرناس التي تحتوي على أرقام مختلفة من بوليسوميس عملية تجزئة بوليسومي بواسطة السكروز تنبيذ فائق التدرج6،7 , 8 , 9-يسمح تحليل الحمض النووي الريبي للكسور بوليسومال ثم قياس التغيرات في الدول المتعدية في مرناس الفردية على نطاق الجينوم، وخلال مختلف الظروف الفسيولوجية4،7، 10-الأسلوب قد استخدمت أيضا لتكشف عن أدوار 5 ‘UTR و 3’ UTR تسلسل في السيطرة على مرناً طواعية11، ودراسة دور ميرناس في القمع متعدية12، كشف العيوب في الريبوسوم نشوء حيوي13 ، وفهم دور البروتينات المرتبطة الريبوسوم مع الأمراض التي تصيب الإنسان14،15. خلال العقد الماضي، برز دور متنام لتنظيم التعبير الجيني أثناء الترجمة أن يوضح أهميتها في الأمراض التي تصيب الإنسان. دليل مراقبة متعدية الجنسيات في السرطان، الأيضية وأمراض الأعصاب هو الساحقة15،16،،من1718. على سبيل المثال، يسهم في التقلبات eIF4E-تعتمد على مراقبة متعدية الجنسيات ذات الصلة بالتوحد في العجز15 وفمرب وتشارك في المماطلة من ريبوسوم في مرناس مرتبطة بالتوحد14. وهكذا، التنميط بوليسومال أداة هامة جداً لدراسة العيوب في التنظيم متعدية الجنسيات في العديد من الأمراض البشرية.
تحليل البروتين الكسور بوليسومال تحت ظروف فسيولوجية مختلفة يشرح وظيفة العوامل المرتبطة ريبوسوم أثناء الترجمة. وقد استخدمت تقنية polysome التنميط في العديد من الأنواع بما في ذلك الخميرة وخلايا الثدييات والنباتات والبروتوزوا10،19،،من2021. معرض الطفيليات الأوالي مثل المثقبيات و ليشمانيا التحكم النسخي محدودة للتعبير الجيني. وتنظم على الجينوم في مجموعات الجينات بوليسيسترونيك التي تفتقر إلى النسخ ينظم مروج22. بدلاً من ذلك، التعبير الجيني إنمائية يتم التحكم في الغالب على مستوى الترجمة البروتين والاستقرار مرناً في مثقبيات الأنواع23،24. ولذلك، فهم التحكم متعدية الجنسيات في غياب تنظيم النسخي أهمية خاصة بالنسبة لهذه الكائنات. التنميط بوليسومال أداة قوية لدراسة بوسترانسكريبشونال تنظيم التعبير الجيني في ليشمانيا25،26،،من2728.
التقدم الذي أحرز مؤخرا في الكشف عن المستويات الفردية مرناس ريال مرة PCR الكمي (RT-qPCR) وكامل الترنسكربيتوم بتسلسل الجيل القادم، فضلا عن التكنولوجيات البروتيوميات، يجلب القرار ومزايا التنميط بوليسومال إلى مستوى جديد. استخدام هذه الأساليب يمكن تمديد بتحليل للكسور بوليسومال الفردية بتسلسل الحمض النووي الريبي العميقة جنبا إلى جنب مع تحليل البروتين لرصد حالة متعدية الجنسيات من الخلايا في نطاق الجينوم. وهذا ما يسمح تحديد اللاعبين جزيئية جديدة تنظم الترجمة تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. نقدم هنا، بوليسومي عالمي التنميط بروتوكول يستخدم في ثلاثة نماذج مختلفة: طفيل ليشمانيا كبيرةومثقف الخلايا البشرية، والأنسجة الحيوانية. نقدم المشورة في إعداد ليساتيس الخلية من الكائنات المختلفة، والاستفادة المثلى شروط التدرج واختيار مثبطات رناسي وتطبيق قبكر RT ولطخة غربية والتفريد الحمض النووي الريبي لتحليل الكسور بوليسومي في هذه الدراسة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تجزئة بوليسومي بالتدرج السكروز جنبا إلى جنب مع الجيش الملكي النيبالي، وتحليل البروتين الكسور وسيلة قوية لتحليل حالة متعدية الجنسيات مرناس الفردية أو ترانسلاتومي كله، فضلا عن أدوار العوامل البروتين تنظم متعدية الجنسيات إليه خلال حالة فيزيولوجية أو المرض العادي. التنميط بوليسومال وتقني?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون لي تشينغ للمساعدة في تسجيل الصوت. البحث تدعمها أموال بدء التشغيل من تكساس تكنولوجيا جامعة مركز علوم الصحة ومن مركز التميز “علم الأعصاب متعدية الجنسيات” والمداواة (كتنت) منح 2017 PN-كتنت-05 “أخرجدهو” A.L.K.؛ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI099380 هوفمان K.Z. جيمس جيم وباكا ر. كريستين العلماء سيسير (مركز “التكامل لوقف” التعليم والبحوث) وكانت مدعومة البرنامج.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
