Summary

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

Published: April 08, 2018
doi:

Summary

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Abstract

Expresión de la proteína adecuada en el momento adecuado y en las cantidades adecuadas es la base de la función normal de la célula y la supervivencia en un entorno rápidamente cambiante. Durante mucho tiempo, los estudios de expresión génica fueron dominados por la investigación a nivel transcripcional. Sin embargo, los niveles de estado estacionario de mRNAs no se correlacionan bien con la producción de proteínas, y la traducción de los mRNAs varía grandemente dependiendo de las condiciones. En algunos organismos, como el parásito Leishmania, la expresión de proteínas está regulada principalmente a nivel traslacional. Estudios recientes demostraron que dysregulation de traducción de proteínas se asocia con cáncer, metabólico, neurodegenerativas y otras enfermedades humanas. Polysome perfilado es un poderoso método para estudiar la regulación de la traducción de proteínas. Permite medir el estado traslacional de mRNAs individuales o estudiar traducción en una escala genoma-ancha. La base de esta técnica es la separación de polisomas, ribosomas, sus subunidades y mRNAs gratis durante la centrifugación de un citoplásmico lisado a través de un gradiente de sacarosa. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles protocolo utilizado en tres modelos diferentes – parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Las células de Leishmania crecen libremente en suspensión y células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente, mientras que el testículo del ratón representa una muestra de tejido animal. Así, la técnica se adapta a todas estas fuentes. El protocolo para el análisis de fracciones polysomal incluye la detección de los niveles de mRNA por RT-qPCR, proteínas por Western blot y análisis de ARN ribosómico mediante electroforesis. El método puede ampliarse aún más por la examinación de mRNAs de asociación con el ribosoma a nivel de transcriptoma por RNA-seq profunda y análisis de proteínas ribosoma asociados por espectroscopía de masas de las fracciones. El método se puede ajustar fácilmente a otros modelos biológicos.

Introduction

Regulación de la expresión génica en las células es controlada por mecanismos transcripcionales y postranscripcional y postraduccionales. Avances en la secuenciación del RNA profunda permiten el estudio de los niveles de mRNA de estado estacionario en una escala genoma-ancha en un nivel sin precedentes. Sin embargo, hallazgos recientes revelaron que nivel de mRNA de estado estacionario no se correlaciona siempre con proteína producción1,2. El destino de una transcripción individual es muy complejo y depende de muchos factores como estímulos internos/externos, estrés, etcetera. Regulación de la expresión génica durante la síntesis de proteína proporciona otra capa de control de expresión necesaria para una respuesta rápida en condiciones cambiantes. Polysome (o “polyribosome”) de perfiles, la separación y visualización de la traducción activa de ribosomas, es un poderoso método para estudiar la regulación de la síntesis de proteínas. Aunque sus primeras aplicaciones experimentales aparecieron en la década de 19603, polysome perfilado es actualmente una de las técnicas más importantes en la proteína traducción estudios4. MRNAs individuales puede ser traducida en más de un ribosoma a la formación de un polysome. Las transcripciones pueden ser estancadas en los ribosomas con cicloheximida5 y mRNAs que contienen diferentes cantidades de polisomas pueden ser separados en el proceso de fraccionamiento polysome por ultracentrifugación gradiente de sacarosa6,7 , 8 , 9. Análisis de ARN de fracciones polysomal entonces permite la medición de cambios en los Estados traslacionales de mRNAs individuales a escala de todo el genoma y en diferentes condiciones fisiológicas4,7, 10. el método se ha utilizado también para revelar el papel de la 5′ UTR y 3′ UTR secuencias en el control del ARNm traducción11, examinar el papel de miRNAs en represión traduccional12, descubrir defectos en biogénesis del ribosome13 y entender el papel de las proteínas del ribosoma asociados con enfermedades humanas14,15. Durante la última década, ha surgido un creciente papel para la regulación de la expresión génica durante la traducción que ilustra su importancia en enfermedades humanas. Las pruebas de control traduccional en cáncer, metabólico y enfermedades neurodegenerativas son abrumador15,16,17,18. Por ejemplo, dysregulation de eIF4E-dependiente control traduccional contribuye al autismo relacionadas con déficits15 y FMRP participa en estancamiento de los ribosomas en mRNAs vinculados al autismo14. Así, polysomal de perfiles es una herramienta muy importante para el estudio de defectos en la regulación traduccional en múltiples enfermedades humanas.

Análisis de la proteína de las fracciones polysomal bajo diferentes condiciones fisiológicas analiza la función de los factores asociados a los ribosomas durante la traducción. La técnica de generación de perfiles polysome se ha utilizado en muchas especies incluyendo levaduras, células de mamíferos, plantas y protozoos10,19,20,21. Parásitos protozoos como Trypanosoma y Leishmania presentan limitado control transcripcional de la expresión génica. Sus genomas se organizan en grupos de gen policistrónico que carecen de transcripción regulada por el promotor22. En cambio, expresión génica desarrollo predominante está controlada a nivel de la proteína traducción y estabilidad del mRNA en tripanosomatídeos especies23,24. Por lo tanto, la comprensión de control traduccional en la ausencia de regulación transcripcional es particularmente importante para estos organismos. Perfiles de polysomal es una poderosa herramienta para estudiar la regulación postranscripcional de la expresión génica en Leishmania25,26,27,28.

Los recientes avances en la detección de niveles de los mRNAs por real tiempo cuantitativo PCR (RT-qPCR) y transcriptoma completo de secuenciación de próxima generación, así como tecnologías de proteómica, trae ventajas de perfiles polysomal a un nuevo nivel y resolución. El uso de estos métodos puede ampliarse aún más por el análisis de fracciones individuales de polysomal por la secuencia de RNA profunda combinada con análisis proteómico para supervisar el estado traslacional de las células en una escala genoma-ancha. Esto permite la identificación de nuevos actores moleculares regular traducción bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles de protocolo que se utiliza en tres modelos diferentes: el parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Presentamos consejos sobre la preparación de lisados de células de diferentes organismos, optimización de condiciones de gradiente, de inhibidores de la Rnasa y aplicación de RT-qPCR, Western blot y electroforesis de RNA para analizar fracciones polysome en este estudio.

Protocol

Todos los tratamientos de animales y manejo de los tejidos obtenidos en el estudio fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Texas Tech University Health Science Center, según los institutos nacionales de Pautas de bienestar animal salud, número de protocolo 96005. Por favor, sacrificar animales vertebrados y preparar los tejidos según las directrices del Comité de uso y cuidado de Animal institucional. Si carece de dicho Comité, por fav…

Representative Results

En este estudio, describimos la aplicación de la técnica de generación de perfiles polysomal en tres fuentes diferentes: parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y testículo de ratón. Las células de Leishmania crecen libremente en el medio líquido en suspensión células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente en las placas y el testículo de ratón representa una muestra de tejido. El método se puede ajustar fácilmente a otros tipos de c?…

Discussion

Fraccionamiento polysome por gradiente de sacarosa combinada con ARN y análisis de la proteína de las fracciones es un método poderoso para analizar estado traslacional de mRNAs individuales o el conjunto translatome, así como roles de factores de la proteína de regulación traduccional maquinaria durante el normal estado fisiológico o enfermedad. Polysomal perfilado es una técnica especialmente adecuada para el estudio de regulación traduccional en organismos como trypanosomátidos incluyendo Leishmania

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen Ching Lee ayuda con grabación de audio. La investigación fue apoyada por los fondos de puesta en marcha de la Texas Tech University Health Sciences Center y por el centro de excelencia de Neurociencia traslacional y terapéutica (CTNT) concede reposo PN 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; en parte por subvenciones de NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman y Kristen R. Baca eran eruditos CISER (centro para la integración de la madre educación e investigación) y fueron apoyados por el programa.

Materials

Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

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Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E. B., Grozdanov, P. N., Huffman, J. C., Baca, K. R., Karamyshev, A., Denison, R. B., MacDonald, C. C., Zhang, K., Karamyshev, A. L. Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis. J. Vis. Exp. (134), e57600, doi:10.3791/57600 (2018).

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