Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

Pflanze-assoziierten mikrobiome bestehen aus dynamischen und komplexen mikrobieller Gemeinschaften bestehend aus Bakterien, Archaeen, Viren, Pilze und andere eukaryotischen Mikroorganismen. Neben ihrer gut untersuchte Rolle bei der Entstehung von Pflanzenkrankheiten können Anlage-assoziierten Mikroben auch Pflanzengesundheit positiv durch Verbesserung der Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress, Förderung der nährstoffverfügbarkeit und Pflanzenwachstum durch Verbesserung die Produktion von Phytohormonen. Aus diesem Grund besteht besonderes Interesse bei der Charakterisierung der Taxa, die Pflanze Wurzel Endospheres, rhizosphären und das umgebende Erdreich zugeordnet. Während einige Mikroben isoliert im Labor erzeugten Medien kultiviert werden können, viele nicht, zum Teil, weil sie auf Symbiotische Beziehungen mit anderen Mikroben berufen können, wachsen sehr langsam, oder erfordern Bedingungen, die in einer Testumgebung nicht repliziert werden können. Weil es die Notwendigkeit für den Anbau umgeht und relativ kostengünstig und hohem Durchsatz ist, Sequenz-basierte phylogenetische Profilierung der Umwelt- und Host-assoziierten mikrobielle Proben eine bevorzugte Methode für die Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft geworden Zusammensetzung.

Die Auswahl der geeigneten Sequenziertechnologien zur Verfügung gestellt von verschiedenen nächste Generation sequencing (NGS) Plattformen¹ richtet sich auf die Bedürfnisse der Nutzer, mit wichtigen Faktoren wie: gewünschte Abdeckung, Amplifikate Länge erwartet Gemeinschaft Vielfalt sowie Sequenzierung Fehlerquote lesen-Länge und die Kosten-pro-Lauf/Megabase. Eine weitere Variable, die in Amplikons-basierte Sequenzierung Experimenten berücksichtigt werden muss ist welches gen verstärkt werden und welche Primer verwendet werden. Bei der Gestaltung oder der Wahl der Primer, sind Forscher oft gezwungen, Kompromisse zwischen der Universalität der Verstärkung und die taxonomische Auflösung aus der daraus resultierenden Amplifikate erreichbar machen. Aus diesem Grund wählte diese Arten von Studien oft Primer und Marker, die selektiv bestimmte Teilmengen der das Mikrobiom abzielen. Beurteilung der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften geschieht häufig durch Sequenzierung eine oder mehrere der hypervariablen Regionen der bakteriellen 16 s rRNA gen^2,3. In dieser Studie beschreiben wir eine Amplikons basierte Sequenzierung Protokoll entwickelt für eine NGS-Plattform dieser Ziele der 500 bp V3-V4 Region der bakteriellen 16 s rRNA-gen, ermöglicht eine breite Verstärkung der bakteriellen Taxa und gleichzeitig ausreichend Variabilität, unterscheiden Sie zwischen verschiedenen Taxa. Darüber hinaus kann dieses Protokoll problemlos für die Verwendung mit anderen Primer-Sets, wie die Ausrichtung auf die ITS2 Marker von Pilzen oder 18 s rRNA Untereinheit der Eukaryoten angepasst werden.

Während andere Ansätze wie Schrotflinte Metagenomik, Metatranscriptomics und einzellige Sequenzierung, andere Vorteile einschließlich gelöst mikrobieller Genome und mehr direkte Messung des Community-Funktion bieten, sind diese Techniken in der Regel mehr teuer und rechenintensiven als die phylogenetische Profilierung hier⁴beschrieben. Darüber hinaus sind durchführen Schrotflinte Metagenomik und Metatranscriptomics auf Wurzelproben ergibt sich einen großen Prozentsatz der Zugehörigkeit zu dem Host Pflanzengenom liest, und Methoden, um diese Einschränkung zu umgehen immer noch entwickelten^5,6.

Wie bei jeder experimentelle Plattform kann Amplikons-basierten profiling eine Reihe von potenziellen Verzerrungen einführen, die bei der experimentellen Design und Daten-Analyse berücksichtigt werden sollten. Dazu gehören die Methoden der Probenentnahme, DNA-Extraktion, Auswahl der PCR Primer und wie Bibliothek Vorbereitung durchgeführt wird. Verschiedene Methoden können die nutzbare erzeugte Datenmenge erheblich beeinträchtigen und können auch behindern die Bemühungen, Ergebnisse von Studien zu vergleichen. Zum Beispiel die Methode zur Entfernung von Rhizosphäre Bakterium⁷ und die Verwendung von verschiedenen Fördertechniken oder Wahl der DNA Extraktion Kits^8,9 haben gezeigt, dass erhebliche Auswirkungen nachgelagerte Analyse führt zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen in Bezug auf die Mikroben Gegenwart und ihrer relativen Häufigkeiten sind. Seit der Amplifikate basierende Profilerstellung angepasst werden kann, kann es schwierig sein, Vergleiche über Studien. Die Erde Microbiome Projekt hat vorgeschlagen, dass die Entwicklung eines standardisierten Protokolls als Mittel zur Minimierung der Variabilität, verursacht durch die Anwendung der Forscher komplexe Systeme wie die Pflanze-assoziierten Microbiome profitieren würden verschiedene Methoden zwischen Studien^10,11. Hier diskutieren wir viele der oben genannten Themen und bieten Anregungen, best practices-wo angebracht.

Das Protokoll zeigt den Prozess der Erhebung Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben aus Sorghum bicolor und Extraktion von DNA mit Hilfe einer etablierten DNA-Isolierung Kit¹¹. Darüber hinaus enthält unser Protokoll einen detaillierte Amplikons Sequenzierung Workflow, mit Hilfe einer häufig eingesetzten NGS-Plattform zur Bestimmung der Struktur der bakteriengemeinschaften^12,13,14. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in einer Vielzahl von Pflanze-Hosts in einer kürzlich veröffentlichten Studie der Rhizosphäre, Wurzeln und verbundenen Böden 18 Monocot Arten einschließlich Sorghum bicolor, Zea Mays, und Triticum Aestivum¹⁵validiert. Diese Methode ist auch für die Verwendung mit anderen Markergene validiert worden, wie durch seine erfolgreiche Bewerbung zum Studium der Pilzen ITS2 Markergens in Studien der Agave Microbiome^16,17 und Erdbeer Microbiome ¹⁸.