استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

ميكروبيوميس المرتبطة بالنباتات تتكون من المجتمعات الميكروبية دينامية ومعقدة تتألف من البكتيريا، العتيقات، والفيروسات والفطريات وغيرها من الكائنات الدقيقة حقيقية النواة. بالإضافة إلى دورها مدروسة في التسبب في أمراض النباتات، الميكروبات المرتبطة بالنبات يمكن أيضا التأثير إيجابيا الصحة النباتية بتحسين التسامح الإجهادات الحيوية واللاحيويه وتعزيز توافر المغذيات، وتعزيز نمو النبات من خلال إنتاج فيتوهورمونيس. ولهذا السبب، يوجد اهتمام خاص في وصف الأصناف التي تربط بجذر نبات اندوسفيريس، ورهيزوسفيريس، والتربة المحيطة بها. بينما يمكن أن تكون بعض الميكروبات المستزرعة في عزلة في مختبر الوسائط التي تم إنشاؤها، كثير لا يمكن، جزئيا لأنها قد تعتمد على علاقات تكافلية مع غيرها الميكروبات، تنمو ببطء شديد، أو تتطلب الظروف التي لا يمكن تكرارها في بيئة معمل. لأنها تلتف الحاجة إلى زراعة وغير مكلفة نسبيا وعالية الإنتاجية، على أساس تسلسل النشوء والتطور التنميط العينات البيئية وما يرتبط بها المضيف الميكروبية أصبحت طريقة مفضلة للمعايرة المجتمع الميكروبي تكوين.

اختيار التكنولوجيات التسلسل الملائم توفيرها من قبل مختلف الجيل التالي التسلسل (خ ع) منصات¹ يتوقف على احتياجات المستخدمين، مع العوامل الهامة بما في ذلك: التغطية المطلوبة، وطول أمبليكون، يتوقع المجتمع التنوع، فضلا عن تسلسل نسبة الخطأ، وطول القراءة، وفي التكلفة–كل–التشغيل/مجباس. هو متغير آخر يحتاج إلى النظر في التجارب المستندة إلى amplicon التسلسل سوف تفصيل ما هي الجينات، وسوف تستخدم كبسولة تفجير ما. عند تصميم أو اختيار الإشعال، كثيرا ما يجبر الباحثين جعل المفاضلات بين الطابع العالمي للتضخيم وقرار التقسيم يمكن تحقيقه من أمبليكونس الناتجة عن ذلك. ولهذا السبب، اختيار هذه الأنواع من الدراسات غالباً ما الإشعال وعلامات التي تستهدف مجموعات فرعية محددة ميكروبيومي بصورة انتقائية. تقييم تكوين المجتمعات البكتيرية شيوعاً أنجزه تسلسل واحد أو أكثر من مناطق هايبرفاريابل 16S البكتيرية الرنا الريباسي الجين^2،3. في هذه الدراسة، يصف لنا أمبليكون أساس تسلسل البروتوكول وضع لمنصة خ ع تلك الأهداف 500 bp V3-V4 المنطقة الجينات الرنا الريباسي 16S البكتيرية، التي تسمح للتضخيم واسعة من الأنواع البكتيرية مع تقلب كافية لتوفير التمييز بين الأنواع المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة أن هذا البروتوكول تطويعها للاستخدام مع مجموعات التمهيدي الأخرى، مثل تلك التي تستهدف علامة ITS2 للفطريات أو وحدة فرعية الرنا الريباسي 18S حقيقيات النوى.

بينما الآخر النهج مثل metagenomics بندقية، وميتاترانسكريبتوميكس، وتسلسل خلية واحدة، توفر مزايا أخرى بما في ذلك حل الجينومات الميكروبية والقياس المباشر أكثر من وظيفة المجتمع، هذه التقنيات عادة أكثر ووصف مكلفة ومكثفة حسابياً من التنميط النشوء والتطور هنا⁴. بالإضافة إلى ذلك، أداء metagenomics بندقية وميتاترانسكريبتوميكس على عينات الجذر غلة نسبة مئوية كبيرة من القراء الذين ينتمون إلى جينوم النبات المضيف، وأساليب للتغلب على هذا القيد لا يزال حاليا نمواً^5،6.

كما هو الحال مع أي برنامج تجريبي، على أساس amplicon التنميط يمكن إدخال عدد من التحيزات المحتملة التي ينبغي أن ينظر فيها أثناء تحليل التصميم والبيانات التجريبية. وتشمل هذه الأساليب لجمع العينات، والحمض النووي استخراج وانتقاء من [بكر] كبسولة تفجير، وكيف يتم إعداد مكتبة. يمكن أن يؤثر تأثيراً كبيرا على كمية البيانات للاستخدام التي تم إنشاؤها بأساليب مختلفة، ويمكن أن يعوق الجهود المبذولة لمقارنة النتائج بين الدراسات. على سبيل المثال، الأسلوب لإزالة البكتيريا رهيزوسفيري⁷ واستخدام تقنيات الاستخراج مختلفة أو الاختيار من الحمض النووي استخراج مجموعات^8،9 قد ثبت أن تأثير كبير تحليل المتلقين للمعلومات، الأمر الذي يؤدي إلى استنتاجات مختلفة فيما يتعلق بأي من الميكروبات الحاضر وعلى وفرة نسبية. حيث يمكن تخصيصها على أساس amplicon التنميط، أن إجراء مقارنات عبر الدراسات يمكن أن يكون تحديا. وقد اقترح المشروع ميكروبيومي الأرض استفادة الباحثين دراسة النظم المعقدة مثل ميكروبيومي المرتبطة بالنبات من تطوير بروتوكولات موحدة كوسيلة لتقليل التقلبات الناجمة عن تطبيق أساليب مختلفة بين الدراسات^10،11. هنا، نحن مناقشة العديد من المواضيع المذكورة أعلاه وتقديم اقتراحات بشأن أفضل الممارسات بحيث المناسبة.

البروتوكول يوضح عملية جمع التربة، رهيزوسفيري، وعينات الجذر من السرغوم ذو لونين واستخراج الحمض النووي باستخدام الحمض النووي عزلة طقم راسخة¹¹. بالإضافة إلى ذلك، لدينا بروتوكول يتضمن سير عمل تسلسل amplicon مفصلة، باستخدام منصة خ ع تستخدم عادة، لتحديد هيكل المجتمعات البكتيرية^12،،من¹³¹⁴. وقد تم التحقق من هذا البروتوكول لاستخدامها في طائفة واسعة من مضيفي النباتات في دراسة نشرت مؤخرا من الجذور، رهيزوسفيري، والتربة المرتبطة 18 monocot الأنواع بما في ذلك السرغوم ذو لونين، ميس زيا، و قمح أيستيفوم¹⁵. هذا الأسلوب كما تم التحقق من للاستخدام مع جينات علامة أخرى، كما تجلى في التطبيق الناجح لدراسة الجينات علامة ITS2 الفطرية في دراسات الأغاف ميكروبيومي^16،17 والفراولة ميكروبيومي ¹⁸.