Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

Завод связанные microbiomes состоят из динамичных и сложных микробных сообществ, состоит из бактерий, археи, вирусов, грибков и других эукариотических микроорганизмов. Помимо их хорошо изучена роль в возникновении болезни растений связанных растений микробы могут также положительно повлиять здоровья растений, повышение толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым наличия питательных веществ и поощрения повышения роста растений через производство фитогормонов. По этой причине в характеристике таксонов, которые ассоциируются с завода корень endospheres, rhizospheres и окружающий грунт существует особый интерес. Хотя некоторые микробы могут быть культивировали в изоляции на лабораторных созданный СМИ, многие нельзя отчасти потому, что они могут полагаться на симбиотические отношения с другими микробами, растут очень медленно, или требуют условий, которые не могут быть реплицированы в лабораторной среде. Потому что он обходит необходимость культивирования и относительно недорогой и высокой пропускной способности, филогенетическое профилирование на основе последовательности экологических и связанных с ними принимающей микробиологических образцов стала предпочтительным методом для assaying микробных композиция.

Выбор соответствующей последовательности технологий, предоставляемые различными следующего поколения виртуализации платформ (НГС)¹ зависит от потребностей пользователей, с важными факторами, в том числе: желаемого охвата, длина ампликонами, ожидается сообщества разнообразия, а также виртуализации-погрешность, чтение Длина и стоимости за запуск/megabase. Какие Джин будет усилен и какие праймеры будет использоваться другой переменной, которая должна рассматриваться в экспериментах на базе ампликон последовательности. При создании или выборе грунты, исследователи часто вынуждены компромисс между универсальностью амплификации и таксономические резолюции достижимые из результирующей ампликонами. По этой причине эти виды исследований часто выбрал грунты и маркеры, которые выборочно целевых конкретных подмножеств микрофлора. Оценке состава бактериальных сообществ обычно осуществляется путем sequencing один или более из гипервариабельных регионов бактериальных 16S рРНК ген^2,3. В этом исследовании, мы описываем ампликон на основе последовательности протокол, разработанный для платформы NGS этого региона цели 500 bp V3 V4 бактериальных 16S рРНК ген, который позволяет для широкого амплификации обеспечивая при этом достаточно изменчивости для бактериальных таксонов различие между различными таксонов. Кроме того этот протокол может быть легко адаптирована для использования с другими наборами грунт, например маркер ITS2 грибов или 18S рРНК Субблок эукариот.

В то время как другие подходы, такие, как ружье метагеномики, metatranscriptomics и одноклеточного последовательности, предлагают другие преимущества, включая решена микробных геномов и более прямого измерения функции сообщества, эти методы обычно более дорого и вычислительных ресурсов, чем филогенетических профилирования описано здесь⁴. Кроме того выполняя метагеномики ружье и metatranscriptomics на образцах корень дает большой процент читает, принадлежащих к принимающей генома растений, и методы, чтобы преодолеть это ограничение, по-прежнему подвергаются развитых^5,6.

Как и в случае с любой экспериментальной платформы, профилирование на основе ампликон можно ввести ряд потенциальных отклонений, которые должны быть рассмотрены в ходе экспериментального проектирования и анализа данных. К ним относятся методы сбора проб, ДНК добычи, отбора праймеры PCR, и как проводится подготовка библиотеки. Различные методы может существенно снизить количество используемых данных и может также затруднить усилия чтобы сравнить результаты исследований. Например метод удаления ризосферной бактерии⁷ и использование методов различных извлечения или выбор ДНК извлечения комплекты^8,9 было показано значительное воздействие течению анализа, что приводит к различные выводы относительно которых микробы формируют настоящее и их относительного обилия. Поскольку можно настроить профилирование на основе ампликонами, делая сравнения различных исследований может быть сложным. Проект микрофлора земли предположил, что исследователи, изучение сложных систем, таких как завод связанные микрофлора выиграют от разработки стандартизированных протоколов как средства минимизации изменчивости, вызванных применением различные методы между исследования^10,11. Здесь мы обсуждаем многие из вышеуказанных тем, и предложение предложения относительно наилучшей практики, где это уместно.

Протокол демонстрирует процесс сбора почвы, ризосфере и корень образцов из Сорго зерновое и извлечения ДНК, используя налаженные ДНК изоляции комплект¹¹. Кроме того наш протокол включает в себя подробный ампликон последовательности рабочего процесса с использованием обычно используемых NGS платформы, для определения структуры бактериальных сообществ^12,,1314. Этот протокол был утвержден для использования в широком диапазоне растений хостов в недавно опубликованном исследовании корней, ризосфере и связанных почвах 18 видов растения, включая¹⁵ гаолян, Zea mays и Triticum aestivum. Этот метод также были проверены для использования с другими маркерных генов, как свидетельствует его успешное применение к изучению грибковых ITS2 маркер гена в изучении агавы микрофлора^16,17 и клубники микрофлора ¹⁸.