Qui, forniamo una dimostrazione del modello cutaneo richiamo della bolla di aspirazione. Il modello consente un semplice accesso a studiare umano in vivo risposte immunitarie, per esempio nel contesto di sviluppo di un vaccino.
Antigene cutaneo-ricordano modelli consentono studi di memoria umana responses in vivo. Quando combinato con induzione della bolla di aspirazione (SB) della pelle, questo modello offre l’accessibilità alle popolazioni rare del rappresentante di cellule T antigene-specifiche della risposta di memoria cellulare nonché la citochina microambiente in situ.
Questo rapporto descrive la procedura pratica di un richiamo cutaneo, un’induzione di SB e un raccolto delle cellule T antigene-specifiche. Per esemplificare il metodo, il test cutaneo alla tubercolina viene utilizzato per il richiamo antigenico in individui che, prima di questo studio, ha subito una vaccinazione di Bacillus Calmette-Guérin contro un’infezione con tubercolosi del micobatterio. Infine, vengono forniti esempi di analisi cytometric di flusso e multisala degli esemplari di SB, illustrandone alte frazioni di polifunzionale antigene-specifici CD4 + T-cellule disponibili con questo metodo di campionamento rispetto con cellule isolate dal sangue.
Il metodo qui descritto è sicuro e mini-invasiva, offre un’opportunità unica di studiare entrambi immunitaria innata e adattativa in vivoe può essere utile per una vasta comunità di ricercatori che lavorano con umani e immunità cellulo-mediata memoria di risposte, nel contesto di sviluppo di un vaccino.
Una pelle SB è un blister artificialmente indotto, che permette per la raccolta delle cellule e fluidi direttamente dalla pelle. La tecnica di innalzamento SBs di vuoto è uno strumento ben noto nel campo della dermatologia, utilizzato per lo studio sull’immunologia della pelle in salute e malattia1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. questo rapporto dimostra come la tecnica di SB combinata con richiamo antigenica cutaneo (metodo di richiamo cutaneo SB) può fornire intuizioni diretta in risposte immunitarie in vivo.
Il principio dietro l’induzione di SB è semplice: una leggera depressione viene applicata ad una piccola zona della pelle. La pressione negativa alla fine costringerà l’epidermide per separare dal derma, creando una bolla locale piena di liquido e cellule1,2,9. Il liquido della bolla può essere raccolto da un’aspirazione fine dell’ago e il contenuto può essere utilizzato per ulteriore studio in vitro.
Negli ultimi anni, c’è stato un crescente interesse nel metodo SB per lo Studio in vivo le risposte immunitarie diverso da malattie limitate alla pelle10,11. Lo studio dell’immunità adattativa in esseri umani è limitato dal fatto che le cellule e citochine di interesse vengono campionate da sangue periferico perché un prelievo invasivo del linfonodo o tessuto mucoso gastrointestinale può essere inaccettabile e immorale. Un esempio è lo studio delle risposte di memoria umana longevo della T-cellula dopo vaccinazione12. A tali prove, il campionamento delle T-cellule può essere una grande sfida, perché la relativa popolazione di cellule che mediano l’immunità risiede nel tessuto linfoide, e solo un numero molto limitato di T-cellule specifiche circolazione nel sangue periferico.
La tecnica di SB offre un’opportunità unica per lo studio delle cellule T di memoria e altre popolazioni cellulari specifici. Dopo l’inoculazione cutanea dell’antigene, le cellule T specifiche per l’antigene sono reclutati dai loro nascondigli linfoide alla pelle e possono facilmente essere campionati da SB. Le applicazioni di ricerca e metodologia di questo modello di richiamo cutaneo sono stati descritti da Akbar et al. nel 20132. Un antigene comunemente usato per il richiamo di pelle è derivato commercialmente disponibili proteico purificato (PPD) di micobatteri utilizzati per eseguire un test cutaneo (TST) tubercolina13, dove PPD viene iniettato nello strato dermico della pelle. In individui con una memoria immunologica esistente verso PPD [ad esempio, gli individui con un’infezione di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) o una precedente vaccinazione di Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], la deposizione di antigene si traduce in un ricordare la risposta con la migrazione alla pelle e un’espansione clonale in vivo di cellule CD4 + T-PPD specifiche2,11,14,15. Di conseguenza, alte frazioni di PPD specifico polifunzionale i T-cells di CD4 + si accumulano nella pelle pronta per il campionamento di SB. T-cellule prelevate da questo metodo hanno dimostrato di essere robusto e sono sufficientemente abbondanti per essere caratterizzato da una gamma di test immunologici e da un lungo periodo in vitro cultura15. Così, il modello di richiamo cutaneo e l’induzione di SB può rivelarsi un metodo prezioso per lo Studio in vivo delle cellule T risposte dalle analisi ex vivo , e una maggiore conoscenza di questo approccio può avvantaggiare i ricercatori con interessi in immunologia cellulare e vaccinologia.
Questo rapporto fornisce la prima guida graduale su come indurre il blister aspirazione di pelle umana in pelle di PPD-iniettato. Il modello di richiamo di antigene cutaneo è dimostrato usando la TST in volontari vaccinati BCG. Infine, l’analisi pertinenti ex vivo delle cellule e citochine isolate da SB è esemplificato. Caratteristiche fenotipiche e funzionali delle cellule T specifiche PPD ottenute con il metodo di SB sono accuratamente descritti altrove2,10,11,16,17, 18 , 19. questa relazione mira a discutere gli aspetti pratici e immunologici della metodologia per facilitare l’applicazione di questa tecnica da altri gruppi di ricerca.
Questo manoscritto descrive una procedura pratica per lo studio della memoria immunitaria umana responses in vivo, utilizzando antigene cutaneo delle cellule e richiamo raccolto tramite induzione aspirazione blister. TST è stato utilizzato come esempio di deposizione di antigene intradermica e richiamo del vaccino di BCG. Infine, un esempio di SB esemplare caratterizzazione mediante analisi di flusso cytometric e multisala citochina è stata fornita, che dimostrano che circa un terzo delle cellule SB erano polifunzionale di antigene-specifiche cellule T del fenotipo memoria effettrici.
I passaggi critici del presente protocollo comprendono la tecnica di iniezione intradermica, l’induzione di aspirazione blister e la puntura della bolla. In primo luogo, una corretta deposizione intradermica richiede personale specializzato. Una deposizione non corretta può portare a risultati non ottimali. PPD è generalmente un antigene cutaneo ben noto e sicuro, ma la sua composizione può variare tra produttori, limitando la comparabilità13,20. Questo rapporto fornisce le istruzioni per una singola deposizione intradermica di 2 TU e facoltativamente due deposizioni parallele (2 x 2 TU), che possono richiedere ulteriore approvazione etica. Tuttavia, altri studi hanno utilizzato 10 TU, che aumentano la probabilità di una pelle forte reazione10,21. Durante la fase di induzione di SB, piccolo aumento graduale della pressione negativa ridurrà il rischio di rottura di emorragia e sul blister. Le possibilità di contaminazione con globuli rossi o leucociti dal sangue sono generalmente basso2. La tecnica di puntura asettica previene la contaminazione microbica ed evitando il contatto tra l’ago puntura e il pavimento della bolla cutanea riduce le impurità di detriti o di cellule cutanee residenti. Tuttavia, alcuni ricercatori preferiscono raccogliere il fluido SB applicando una pressione di rotolamento per il blister perforato10. Può essere necessario forare i setti all’interno del blister. La stessa tecnica di SB è minimamente invasiva; SBs compresso guariscono senza cicatrici e infezioni sono molto rare. 2 tuttavia, può verificarsi un certo grado di ipo-pigmentazione e induzione di SB dovrebbe probabilmente essere evitato in persone con una storia di colloide cicatrici.
Limitazioni tecniche includono basso cellulare totale rendimenti e conseguenza limitati opzioni per l’archiviazione a lungo termine. Le relazioni tra la resa del leucocita, le risposte cliniche di TST, la dimensione della bolla e contaminazione dell’eritrocito è stato accuratamente descritto altrove2,10. Negli esperimenti BCG-richiamo qui presentati (Figura 1), la resa totale mediana da ogni blister era 50.000, implicando un set-up sperimentale e su piccola scala, utilizzando queste cellule, soprattutto se SBCs sono studiati da solo15. Tuttavia, la popolazione di cellule T specifica in un campione di SB supera per lo più quello che è trovato in campioni di PBMC in entrambi i conteggi relativi e assoluti delle cellule. Nell’esempio presentato nella Figura 2, il numero di cellule T specifiche PPD triple-positivi in un campione di 100.000 SB cellule era più di 2 x maggiore rispetto al numero trovato in 1 x 106 PBMCs dallo stesso donatore (dati non mostrati). Un segnare visivo della reazione TST è il più comune metodo clinico per la valutazione della memoria di M. tuberculosis . Della nota, la reazione immunologica adattiva sottostante non picco allo stesso tempo come la clinica pelle reazione2,21. Non tutti i vaccinati BCG o Mtb-gli individui esposti svilupperà forti reazioni di TST e strategie per la classificazione e una gestione dei campioni da TST non-responder, come pure una preesistenza sensibilizzazione micobatterica nella popolazione di studio, devono essere considerati prima di iniziare un processo di richiamo utilizzando questo metodo. Inoltre, in entrambi campionamento SB e segnare visivo, c’è un potenziale per una polarizzazione teorica in individui con le risposte di pelle riduttrice dovuto globale o dermo-affine alterato l’immunità, come si è visto, per esempio, l’infezione da HIV e determinate fasce di età2, 13,18,20. Inoltre, un’amplificazione immunologica della reazione con ripetuti test TST è ben noto20,22. Tuttavia, i fenotipi cellulari SB rimangono piuttosto costanti quando TSTs sono ripetute10. Questa osservazione sostiene il ruolo di richiamo di SB in studi longitudinali delle risposte immunitarie cellulari.
Per immunologi T-cellula, richiamo SB permette la raccolta delle frazioni alte di cellule antigene-specifiche. Tuttavia, i tempi di SB per un campionamento da un PPD-deposizione sono critico come sia la composizione cellulare e il microambiente di citochina cambiano nel tempo. In questo protocollo, vesciche erano indotto 7 giorni post-sfida e le cellule isolate erano principalmente CD4 + effettrici cellule T di memoria tra cui alte frazioni delle cellule con una co-espressione di IFN-γ, TNF-α e il-2. Queste osservazioni sono in linea con precedenti studi che descrivono come attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T si verifica nella pelle di PPD-innescato2,15,21. Studi cinetici di SB in individui sensibilizzati PPD suggeriscono che la risposta di pelle molto precoce è aspecifica; Tuttavia, già entro i primi giorni dopo la sfida di PPD, la risposta diventa dominata da T-cells CD4 + (entrambi fenotipi di memoria memoria ed effettrici centrali sono state descritti) e, dopo 3 giorni, la risposta è dominata da alte frazioni di PPD specifiche citochine producendo i T-cells di CD4 +2,8,10,15,21. Questa risposta adattativa citochina rimane rilevabile per più di 2 settimane2,8,10,23. Giorno 7 post-TST sembra essere il punto di tempo ottimo per la raccolta della citochina producendo le cellule di T di memoria CD4 +2. Tuttavia, altri punti di tempo possono, naturalmente, essere pertinenti a seconda dell’antigene e la risposta di interesse. Da notare, in uno studio, la risposta adattativa di PPD è stata segnalata per un po’ prima di picco con una diminuzione della secrezione di citochina pro-infiammatoria già a 5 giorni post-TST10.
SB liquido contiene alti livelli di citochine pro-infiammatorie e di altre proteine indicati per essere rappresentante della pelle microambiente15,24. Studi di cinetica hanno dimostrato che TNF-α e IFN-γ livelli nel picco fluido SB dopo 3 giorni mentre il picco dei livelli IL-2 dopo 7 giorni2,10, probabilmente riflettendo la dominanza di risposte adattative in questa fase successiva. Perché le cellule SB sono stati attivati in vivo, esibiscono un rilascio di citochine spontaneo alta così come un potenziale per un rilascio specifico su restimolazione (Figura 3 e 4).
Questa relazione si concentra sulla immunità delle cellule T CD4 +. Come dimostrato nella Figura 2, la maggior parte delle T-cellule isolate era infatti CD4 +, mentre non c’erano quasi nessun CD8 + cellule T nell’aspirazione blister fluido. Questo è in linea con altri studi di SB PPD-richiamo reporting proporzioni basse e un’inferiore capacità migratoria delle T-cellule CD8 + rispetto a cellule T CD4 +2,8,10,23. Un’ulteriore caratterizzazione del CD8 + contributo sarebbe preferibile; Tuttavia, questo esula dall’ambito della presente relazione.
Le cellule T sono considerate essenziali per il controllo immune di Mtb; Tuttavia, è stato difficile identificare un affidabile correlato della tutela riflettuto nella risposta immunitaria adattativa dal sangue25,26. Questo blocco impedisce gravemente lo sviluppo di nuovi vaccini di TB, come attualmente non esiste alcuna alternativa all’efficacia di grandi dimensioni e molto costose prove27. Gli sviluppatori di vaccino TB determinano l’immunogenicità del vaccino valutando cambiamenti piccoli e transitori nelle popolazioni vaccino-specifiche cellule T nel sangue28,29. Tuttavia, è lecito chiedersi se sia rilevante la piccola frazione di cellule T antigene-specifiche nel sangue di circolazione (cioè, in grado di migrazione verso il sito di un’infezione e rappresentante del microambiente di T-cellula-ricco, il controllo Mtb) 27 , 30 , 31 .
Basato su studi precedenti e i dati presentati nel presente documento, il modello di richiamo cutaneo SB rappresenta un potenziale non sfruttato per lo studio delle cellule T specifiche del vaccino. Non solo il modello consente un richiamo di un vaccino risposta generata da decenni, permette anche la valutazione della memoria vera potenziale in un contesto di tessuto-specifica15,18,19,21. Romanzo, specifici test cutanei, che includono antigeni compreso anche dei vaccini subunità TB, suggerire nuove opportunità per la valutazione del vaccino utilizzando questo modello28,32. Inoltre, analisi trascrittomica suggeriscono che una risposta comunicata per cellule immunitarie generata nella pelle di PPD-sfidati sia simile alla risposta trovata in Mtb-infettato del polmone18.
Mentre biopsie di pelle anche consentono una raccolta delle cellule della pelle e forniscono informazioni spaziali, confrontati con campionamento SB, il metodo è più invasivo e richiede trattamento enzimatico o meccanico per preparare sospensioni unicellulari33. Misurazioni dei marcatori delle cellule e citochine sono comparabili tra i due metodi2,10.
Il metodo di aspirazione blister è già stato applicato in molti settori della ricerca medica oltre alla dermatologia, da solo o in combinazione con una sfida di pelle sistemica o locale. Gli esempi includono studi di sepsi, malattia linfoproliferativa associata al virus di Epstein – Barr, neuropatia diabetica, gli effetti di assunzione di glucocorticoidi e prove umane test anticorpi terapeutici o modelli per terapie mirate T-cellula10 ,34,35,36,37,38.
Da un punto di vista terapeutico, il metodo di richiamo cutaneo SB offre vantaggi unici per studiare la memoria centrale di T-cellula potenziale e -da entrambi un biologiche e tecniche il punto di vista, la pelle sembra fornire un campione rilevante vano2, 15,18,19,21. In particolare, rispetto al tradizionale campionamento passivo di PBMCs di circolazione, il metodo di richiamo cutaneo SB consente lo studio delle cellule T che hanno dimostrato la capacità di migrare dal linfonodo in risposta al loro antigene pertinenti e completare il locale espansione e differenziazione in un tessuto-specifica in vivo contesto15,18,19,21.
In conclusione, il modello ha dimostrato qui potrebbe essere rilevante per i ricercatori nel campo dell’immunità adattiva umana e agenti mirati della T-cellula (cioè, nella ricerca di vaccinologia o cancro malattia infettiva). Il modello TST applicato in questo protocollo è, naturalmente, di particolare rilevanza nel campo della vaccinologia TB. Tuttavia, il concetto di base di questo modello è fortemente applicabile in altri campi di ricerca.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Mads Radmer Jensen per i suoi consigli pratici e accademici; Lau Lindqvist e Kaare Svejstrup per consulenza tecnica; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt e Solveig W. Harpøth per la loro assistenza tecnica; il personale presso l’ambulatorio di Gentofte TB per la loro formazione in amministrazione PPD; e tutti i volontari per la partecipazione allo studio. Questo progetto è finanziato dal programma europeo Commissione H2020 [concessione numero TBVAC2020 643381], e vorremmo ringraziare i partner del Consorzio per le discussioni fruttuose.
Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |