勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

人間のボランティアの使用を含む、以下に述べるすべての方法は、デンマークのデータ保護局 (jr.nr. 2015-57-0102) 健康研究倫理 (H-15002988) デンマーク委員会によって承認されています。PPD は、人間の使用のために承認し、製造元から提供される適切な投与量で投与認定製品をする必要があります。投与量または投与の任意の偏差がありますその他の倫理的な承認とボランティアがインフォームド コンセントを与える必要があります。 1. ツベルクリン反応検査 ボランティアからの口頭および書面によるインフォームド コンセントを取得します。注入前にボランティアを理解でき、可能な限り副作用を含むプロシージャを確認します。注: このプロトコルに固有の選択基準は、> 18 歳、文書化された BCG 予防接種です。研究の質問に応じて基準が異なる場合があります (すなわち、掲載基準が正の TST の証拠をあることができる)。 人間用 [20 ツベルクリン単位 (TU)/mL] PPD の既製のソリューションを使用します。アルコール綿棒を使用バイアルのゴム栓を消毒します。 注射部位を準備します。 ボランティアの前腕の腹側に注射部位を探します。 平面に腕手のひらアップを置き、前腕、肘関節から約 5-10 cm の上から 3 番目のエリアを選択します。傷、静脈、または損傷した皮膚の明確なまま。 アルコール綿棒を使用して領域を消毒します。 PPD 溶液を調製します。 1 mL 滅菌注射器を使用、27-30 G/短い (例えば、12 mm) 針を固定します。 ゆっくり混ぜるし、PPD 溶液 0.1 mL を熱望します。目に見える気泡がないことを確認してください。 PPD 皮内注射注: この手順は、単一 PPD 蒸着を行う方法を説明しますが、同じ腕の PPD の複数の証言があります。ただし、これは特定の倫理的な承認を必要があります。 皮膚を伸ばすし、上向き傾斜で 5 ~ 15 ° の角度で針を皮膚にポイントします。 皮膚の真皮層に針の先端を挿入し、先端がほぼ表皮を通して見えるかどうかを確認します。 PPD 溶液 0.1 mL をゆっくりと注入します。注: 正しく管理されている場合 6-10 mm の薄い丘疹が表示されますすぐに。丘疹は、約 10 分後に消えます。 2 つ以上の調書を作るときは、注射部位の肘と手首の領域からの良い距離を保ちながら最大分離 (5-10 cm) を目指してください。注: この皮膚テストの応答の潜在的な合流を防ぎ、吸引両院の連続測位を可能に。 2. 3 日目 – 皮膚反応の評価 48-72 時間後の皮膚反応の大きさに注意してください。硬結 (腫れ) を測定していない反応の紅斑 (発赤)。 ハードを触診指を使って腫れし、ボールペンを使用して硬結の端をマークします。定規を使用して硬結径を測定し、mm の結果に注意してください。注: 硬結径の読書は、吸引のオリフィス径の選択をガイドがあります。 3. 吸引水疱誘導 – 7 日目 吸引装置を組み立てます。注: デバイス単位で吸引、吸引水疱誘導用添付チャンバーと真空ポンプです。このデモで使用されているデバイスは、カスタムが、吸引装置ユニットも市販されています。ポンプは-20-40 kpa の範囲内で調節可能な安定性と信頼性の否定的な圧力を提供する必要があります。このメソッドを使用して実験を行う前に地域の倫理的な承認を取得必要があります。 まず、底面オリフィス プレートとチャンバーと接続ホース窓板を組み立てることによって吸引を準備します。真空ポンプ室接続ホースにしっかりと取り付けます。注: 部屋は、人間の皮膚との接触に適してする必要があります、ブリスター誘導用穴付き底板、ブリスターのビジュアル監視を可能にするウィンドウのトップ プレートを含める必要があります。 皮膚反応のサイズを基準にしてオリフィス プレートの最適なオリフィス径を決定します。オリフィスのサイズが大きくなるほどのブリスター。 オリフィス プレートやボランティアの皮膚消毒アルコール綿棒を使用します。 皮膚に吸引を取り付けます。 ボランティアの腕は快適に休んでいることを確認します。 吸引部の底板の穴は PPD 反応にして皮膚反応の中心が表示されることを確認します。 ストラップ緩くチャンバーを確保: 否定的な圧力を適用すると、商工会議所が肌にくっつくし、地位を維持します。 吸引装置をオンにして-20 kpa の圧力を調整します。 30 分後-25 kPa に負の圧力を高めます。 60 分後さらに-30 kPa に負圧を上げます。 水疱が完全に形成されるまで-30 kPa の圧力を維持します。このプロトコルで提供される負圧がカスタマイズされた楽器に固有であることを確認します。他の設定でプロトコルを適用するときに、圧力を少し調整する必要があります。注: ブリスター誘導フェーズ範囲 60 ~ 180 分 (1-3 h) ブリスターの発生は、しばしばかゆみ感覚関連付け最後 30 分内で発生する実際の水疱形成とです。単一または複数のマージ水疱と水疱が発生します。かどうかブリスター破裂や出血が発生します、ゆっくりと圧力を解放してブリスター誘導を終了することを助言します。 水疱が完全に形成された後、圧力を解放、水疱が破裂せず皮膚から吸引を慎重に取り外します。 周辺皮膚の柔らかいドレッシングを適用し、水疱をハード キャップ (例えば、50 mL プラスチック チューブから) を配置します。 柔らかい伸縮性のある包帯が続く非アレルギー サージカル テープでキャップを固定します。 次の 12-24 時間のブリスター エリアに過大な物理的な負担を避けるためにボランティアを指示します。 4 水疱液 – 8 日目の収穫 8 日目に優しく保護ドレッシングを削除し、皮膚消毒スプレーで水疱を消毒します。 水疱内容を収穫するのに 23 G 針で 2 mL 滅菌注射器を使用します。ブリスター屋根の上・横側に針を挿入し、ゆっくりと液体を吸引します。空洞の床に触れないように、すべての流体を収穫することを確認します。 折りたたまれたブリスターにあてがいます。 生殖不能の管に水疱液を転送します。ボリュームに注意してください。 600 x g 卓上遠心分離機を用いた 4 分でダウン水疱液をスピンします。 上清を別のチューブに転送し、500 μ L の細胞培地で細胞ペレットを再懸濁します。注: セルはカウント、さらに分析する準備が整いました。清は、使用するまで-20 ~-80 ° C で保存できます。 5. 吸引の解析ブリスター細胞や体液 注: セルと皮膚吸引水疱から得られた流体の解析手順を提供してこのプロトコルの範囲内ではありません。しかし、このレポートの代表的な結果を提供するために細胞内染色の流れ、フローサイトメトリーおよびマルチプレックス解析を行った。方法論を簡単に説明します。 フローサイトメトリー Ppd ファイルの 10 μ G/ml と 1 BCG 接種ボランティアから吸引水疱から分離された 1 × 105新鮮な細胞の懸濁液を刺激し、37 ° C および 5% で細胞をインキュベート CO2.処理並列培養細胞が含まれます。 1 x 106 PBMCs は 10 μ g/ml の ppd ファイルの 1 BCG 接種ボランティアから得られた懸濁液を刺激し、37 ° C で 5% 混合物を孵化させなさい CO2.処理並列培養細胞が含まれます。 2 時間後、Brefaldin A とモネンシンのすべてのセルを扱うし、37 ° C で 6 時間それらを孵化させなさい ライブ/死者-汚れ-BV510、抗 CD4 AF780、抗 CD3 BV421、抗 CD8-PerCP Cy5.5、アンチ CCR7 PE、アンチ CD45RA BV786、反 IFN-γ AF700、アンチ-TNF-α-PE-Cy7、抗 IL-2 FITC のパネルと細胞を染色します。 PBMC パネルで FMO コントロールが含まれます。 流れの cytometer で、フローサイトメトリーによる解析を行い、関連するソフトウェアを使用して結果を分析します。 サイトカイン産生 cd 3 + cd 4 +/cd8-サブセット次ゲート方式のゲート: シングレット – > 実行可能な CD3 + – > cd 4 +/cd8 – – > IFN-γ +、TNF-α + または IL-2 +。 次のゲートの戦略を使用してエフェクター メモリ セル人口のゲート: シングレット – > 実行可能な CD3 + – > cd 4 +/cd8 – – > CCR7 – CD45RA-。 論理ゲートを使用して個々 のサイトカイン プロファイルを計算します。 サイトカインのリリースのデモ サイトカインのデモは、生体内でリリースは、IL-2、IFN-γ、TNF-α、イリノイ州のレベルを定量化するマルチプレックス解析を使用-10、および 4 のボランティアから解凍吸引水疱液で IL 13。 得られる細胞のサイトカインのリリースのデモ吸引水疱ex vivo、使用新鮮な吸引水疱細胞、PBMCs 1 BCG 接種ボランティアから得られます。 PBMC に感染しMtb H37Rv の 100 コロニー形成単位 (CFU) ブリスター細胞を吸引し、4 日間それらを孵化させなさい。 マルチプレックス解析を使用して、IL-2、IFN-γ、TNF-α、イリノイ州のレベルを定量化する-10、およびすべての培養上清中 IL 13。 上計算制限に試金の計算範囲の上調整します。