بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

ويصف هذه المخطوطة إجراء عملي لدراسة الذاكرة المناعية البشرية الردود في فيفو، استخدام مستضد الجلدية نذكر وخلية الحصاد بالاستقراء نفطة شفط. تجارة الرقيق عبر الأطلسي كمثال لترسب مستضد الأدمة ونذكر لقاح بي سي جي. وأخيراً، كان مثال لتوصيف العينة SB بتحليل تدفق سيتوكين سيتوميتريك ومتعدد المقدمة، تبين أن حوالي ثلث الخلايا SB كانت محددة مستضد بوليفونكشونال الخلايا التائية من النمط الظاهري الذاكرة المستجيب.

وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول تقنية حقن داخل الأدمة واستحثاث نفطة شفط ثقب نفطة. أولاً، يتطلب ترسب الأدمة صحيح الموظفين المدربين. يمكن أن يؤدي ترسب غير صحيحة إلى نتائج دون المستوى الأمثل. PPD عموما مستضد جلدية المعروفة والآمنة، ولكن قد تختلف تركيبته بين المصنعين، يحد من إمكانية المقارنة بين^13،20. ويقدم هذا التقرير التعليمات المتعلقة ترسب داخل الأدمة واحد تو 2، وترسبات موازية اختيارياً اثنين (2 × 2 تو)، التي قد تتطلب الموافقة الأخلاقية إضافية. غير أن دراسات أخرى استخدمت تو 10، التي تزيد من احتمال رد فعل الجلد قوية^10،21. أثناء الخطوة التعريفي SB، زيادات تدريجية صغيرة في الضغط السلبي سوف يقلل خطر تمزق نزيف ونفطه. وهناك احتمالات التلوث مع خلايا الدم الحمراء أو leucocytes من مجرى الدم منخفضة بصفة عامة². تقنية ثقب معقمة تمنع التلوث الميكروبي وتجنب الاتصال بين ثقب الإبرة والكلمة نفطة عن طريق الجلد يقلل من الشوائب من الحطام أو خلايا الجلد المقيمين. ومع ذلك، تفضل بعض الباحثين حصاد SB السوائل عن طريق تطبيق ضغط متداول إلى نفطة ثقب¹⁰. وقد يكون من الضروري على ثقب سيتا داخل الفقاعات. تقنية SB نفسها مينيملي؛ SBs المنهار تشفي دون ندبات والتهابات نادرة جداً. ² ولكن قد يحدث قدر من هيبو-تصبغ وربما ينبغي تجنبها SB التعريفي في الناس مع تاريخ من تندب غروانيه.

وتشمل القيود التقنية الخلية إجمالي انخفاض غلة المحاصيل وخيارات محدودة وبالتالي للتخزين على المدى الطويل. وكانت العلاقات بين الغلة leucocyte السريرية TST الردود، وحجم نفطة، والتلوث بكرات الدم الحمراء ووصف دقيق في مكان آخر^2،10. في بي سي جي-نذكر التجارب المعروضة هنا (الشكل 1)، كان متوسط العائد الإجمالي من نفطة كل 50,000، مما يعني ضمناً مجموعة تجريبية صغيرة الحجم باستخدام هذه الخلايا، لا سيما إذا كانت SBCs وحدها درس¹⁵. ومع ذلك، يتجاوز السكان تي خلية محددة في نموذج SB معظمهم ما هو موجود في عينات ببمك في كلتا الحالتين الخلية النسبي والمطلق. في المثال قدم في الشكل 2، كان عدد الثلاثي-إيجابية PPD المحددة خلايا-تي في عينة خلايا SB 100,000 أكثر من 2 × أكبر من رقم تم العثور عليها في 1 × 10⁶ ببمكس من نفس الجهة المانحة (البيانات لا تظهر). سجل مرئي لرد فعل تجارة الرقيق عبر الأطلسي هو الأسلوب السريرية الأكثر شيوعاً لتقييم الذاكرة السل م . من المذكرة، لا ذروة رد فعل مناعية تكيفية الكامنة في نفس الوقت كرد فعل الجلد السريرية^2،21. ليس كل تطعيم ضد السل أو المواضيع المتميزة-سوف تضع الأفراد المعرضين تجارة الرقيق عبر الأطلسي ردود فعل قوية واستراتيجيات للتصنيف، ومناولة العينات من غير تجارة الرقيق عبر الأطلسي المستجيبين، فضلا عن توعية المتفطرات الموجودة مسبقاً في جمهرة الدراسة، يلزم النظر فيها قبل الشروع في محاكمة التذكير باستخدام هذا الأسلوب. أيضا، في كل من بينالي الشارقة أخذ العينات والتسجيل المرئي، هناك احتمال لوجود تحيز نظرية في الأفراد مع الردود انخفاض الجلد نظراً لعالمية أو المتصلة بالجلد ضعف الحصانة كما يتضح، على سبيل المثال، في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وبعض الفئات العمرية^{2، 13،،}من¹⁸²⁰. وبالإضافة إلى ذلك، تعزيز المناعية لرد فعل تجارة الرقيق عبر الأطلسي مع التجارب المتكررة هو معروف^20،22. بيد أن تعمل الخلية SB تظل ثابتة بدلاً من ذلك عندما يتم تستس المتكررة¹⁰. وتدعم هذه الملاحظة دور يذكر س. ب في الدراسات الطولية للاستجابات المناعية الخلوية.

للذيفان تي خلية، يسمح نذكر بينالي الشارقة للحصاد للكسور عالية من خلايا محددة مستضد. توقيت بينالي الشارقة لأخذ عينات من PPD شهادة غير حاسمة لتكوين الخلوية والمكرويه سيتوكين تتغير بمرور الوقت. في هذا البروتوكول، بثور كانت المستحث 7 أيام بعد انتهاء التحدي والخلايا المعزولة كانت أساسا المستجيب الذاكرة CD4 + تي الخلايا بما في ذلك الكسور عالية من الخلايا باستخدام تعبير المشارك تنف-α, IFN-γ وايل-2. هذه الملاحظات بما يتفق مع الدراسات السابقة التي تصف كيفية حدوث تي خلية التنشيط وانتشارها، والتمايز في الجلد معبي PPD^2،،من¹⁵²¹. دراسات SB الحركية في PPD توعية الأفراد توحي بأن استجابة البشرة المبكر جداً غير محدد؛ بيد فعلا خلال الأيام الأولى التي أعقبت PPD-التحدي، يصبح تهيمن الاستجابة خلايا CD4 + تي الخلايا (كلا تعمل وسط الذاكرة في الذاكرة والمستجيب قد وصف) و، بعد 3 أيام، الرد يهيمن الكسور عالية من سيتوكين PPD الخاصة المنتجة لخلايا CD4 + الخلايا التائية^2،،من^810،15،21. وتظل هذه الاستجابة التكيفية سيتوكين يمكن كشفها لأكثر من 2 أسابيع^2،،من^810،23. بوست يوم 7-تجارة الرقيق عبر الأطلسي، على ما يبدو، نقطة الوقت الأكثر الأمثل لجمع سيتوكين إنتاج الخلايا التائية الذاكرة CD4 +². ومع ذلك، النقاط مرة أخرى بطبيعة الحال، يمكن ذات الصلة اعتماداً على مستضد واستجابة للاهتمام. من المذكرة، في دراسة واحدة، أبلغ PPD الاستجابة التكيفية ذروة قليلاً في وقت سابق مع انخفاض في إفراز سيتوكين برو الملتهبة بالفعل في 5 أيام بوست-تجارة الرقيق عبر الأطلسي¹⁰.

السائل س. ب يحتوي على مستويات عالية من السيتوكينات الموالية التحريضية والبروتينات الأخرى تبين أن الممثل الجلد المكروية^15،24. وقد أظهرت الدراسات الحركية أن تنف-α و IFN-γ المستويات في ذروة SB السوائل بعد 3 أيام بينما إيل-2 مستويات الذروة بعد 7 أيام^2،10، ربما يعكس هيمنة استجابات التكيف في هذه المرحلة بعد. لأن الخلايا SB قد تم تفعيلها في فيفو، هم يعرضون إطلاق سراح سيتوكين عفوية عالية، فضلا عن احتمال إطلاق سراح محددة عند ريستيموليشن (الشكل 3 و 4).

ويركز هذا التقرير على الحصانة CD4 + تي خلية. كما يتبين في الشكل 2، وكانت غالبية تي-الخلايا المعزولة في الواقع خلايا CD4 +، بينما كانت هناك تقريبا لا CD8 + الخلايا التائية في الشفط نفطة السائل. وهذا ما يتفق مع دراسات أخرى نذكر SB PPD الإبلاغ عن نسب منخفضة وقدرة المهاجرة أقل شأنا من CD8 + تي الخلايا CD4 + “تي” الخلايا^2،،من^810،23بالمقارنة. وصف مزيد من مساهمة CD8 + سيكون من الأفضل؛ ومع ذلك، هذا خارج نطاق هذا التقرير.

خلايا تي تعتبر أساسية لمراقبة محصنة من المواضيع المتميزة؛ ومع ذلك، كان من الصعب التعرف ربط موثوقة لحماية يتجلى في الاستجابة المناعية التكيفية من^25،الدم²⁶. هذا الحاجز شدة يعرقل تطوير لقاحات السل الجديدة، كما أن هناك حاليا أي بديل لفعالية كبيرة ومكلفة للغاية محاكمات²⁷. تحديد مطوري لقاح السل لقاح الاستمناع بتقييم التغييرات الصغيرة وعابر في السكان تي خلية خاصة باللقاح في^28،الدم²⁹. ومع ذلك، من المشكوك فيه ما إذا كان جزء صغير من تعميم محددة مستضد خلايا تي في الدم الصلة (أي، قادرة على الانتقال إلى موقع الإصابة والممثل لمراقبة المكروية T الخلية-الغنية المواضيع المتميزة) ^{27 , 30 , 31} .

استناداً إلى الدراسات السابقة والبيانات المقدمة في هذه الوثيقة، نموذج استدعاء الجلدي SB يمثل بإمكانيات غير مستغلة لدراسة الخلايا التائية الخاصة باللقاحات. ليس فقط تمكين النموذج أذكر منذ عقود اللقاحات الاستجابة التي تم إنشاؤها، كما يسمح تقييم الذاكرة الحقيقية المحتملة في سياق الخاص بالانسجة^15،18،،من¹⁹²¹. الرواية، واختبارات الجلد المحددة، التي تشمل المستضدات تتألف أيضا من المرشح فرعية للقاحات السل، تشير إلى فرص جديدة لتقييم اللقاحات باستخدام هذا النموذج^28،32. علاوة على ذلك، توحي التحليلات ترانسكريبتوميك أن الخلية – mediated استجابة المناعية المتولدة في الجلد PPD، تحدي مشابه للرد في المواضيع المتميزة-إصابة الرئة¹⁸.

بينما خزعات الجلد لكمه أيضا السماح لحصاد خلية من الجلد وتوفير المعلومات المكانية، بالمقارنة مع أخذ العينات بينالي الشارقة، الأسلوب أكثر الغازية ويتطلب المعالجة الانزيمية أو ميكانيكي لإعداد تعليق خلية واحدة³³. قياسات علامات السيتوكينات وخلية قابلة للمقارنة بين أسلوبي^2،10.

فعلا طبق طريقة الشفط نفطة في العديد من مجالات البحوث الطبية إلى جانب الأمراض الجلدية، أما وحدها أو في تركيبة مع تحدي جلد الجهازية أو المحلية. وتشمل الأمثلة الدراسات الانتان والأمراض المرتبطة بفيروس ابشتاين-بار ليمفاوية، واعتلال الأعصاب السكري، جلوكوكورتيكويد تناول الآثار والتجارب البشرية اختبار الأجسام المضادة العلاجية أو نماذج للعلاجات تي-الخلية المستهدفة^{10 ،34،35،36،،}من³⁷³⁸.

من وجهة نظر علاجية، يقدم الأسلوب نذكر الجلدي SB مزايا فريدة من نوعها لدراسة الذاكرة تي خلية وسط المحتملة ومن كلا بيولوجية والتقنية الجلد من وجهة نظر، ويبدو أن توفير حجرة عينات ذات صلة^{2، 15،18،،}من¹⁹²¹. على وجه الخصوص، بالمقارنة مع أخذ العينات التقليدية السلبية، وتعميم ببمكس، الأسلوب نذكر الجلدي SB يسمح لدراسة الخلايا التائية التي أثبتت قدرة على ترحيل من العقدة الليمفاوية ردا على مستضد ذات الصلة بهم، وإكمال المحلي التوسع والتمايز في الأنسجة على حدة في فيفو سياق^15،18،،من¹⁹²¹.

وفي الختام، أظهر النموذج هنا يمكن أن تكون ذات صلة للباحثين داخل ميدان الإنسان مناعة التكيفية وتي خلية استهداف عملاء (أي، في بحوث اللقاحات أو سرطان الأمراض المعدية). تجارة الرقيق عبر الأطلسي النموذج المطبق في هذا البروتوكول، بطبيعة الحال، ذات أهمية خاصة في مجال اللقاحات السل. بيد أن المفهوم الأساسي لهذا النموذج ينطبق عاليا في ميادين أخرى من البحوث.