Summary

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Published: May 15, 2018
doi:

Summary

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Abstract

Willekeurige mutagenese van een target-gen wordt vaak gebruikt om te identificeren van mutaties die opbrengst van het gewenste fenotype. Van de methoden die kunnen worden gebruikt om willekeurige mutagenese, foutgevoelige PCR is een handige en efficiënte strategie voor het genereren van een diverse pool van mutanten (dwz., een mutant bibliotheek). Vergissing-geneigd PCR is de methode van keuze wanneer een onderzoeker wil muteren van een vooraf gedefinieerde regio, zoals de codering regio van een gen terwijl andere genomic regio’s onaangetast. Nadat de mutant bibliotheek wordt versterkt door foutgevoelige PCR, moet het worden gekloond in een geschikte plasmide. De grootte van de bibliotheek gegenereerd door foutgevoelige PCR wordt beperkt door de efficiëntie van de klonen stap. Echter in de kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe, kan de klonen stap worden vervangen door het gebruik van een zeer efficiënte one-step fusie PCR voor het genereren van constructies voor transformatie. Mutanten van gewenste fenotypen kunnen vervolgens worden geselecteerd met behulp van passende verslaggevers. Hier beschrijven we deze strategie in detail, nemen als voorbeeld, een verslaggever aan centromeric heterochromatin ingevoegd.

Introduction

Voorwaartse genetica is een klassieke methode waarin onderzoekers zoeken natuurlijk voorkomende mutanten die weer een bepaalde fenotype en genetische analyses uitvoeren. In omgekeerde genetica, mutaties worden ingevoerd in een gen van belang en het fenotype is onderzocht. In het laatste geval, wordt willekeurige mutagenese van een target-gen vaak gebruikt voor het genereren van een pool van mutanten die vervolgens voor de gewenste fenotypen, zoals temperatuur gevoeligheid zijn geselecteerd of gewijzigd enzymatische activiteit. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om willekeurige mutagenese, met inbegrip van foutgevoelige PCR1; UV bestraling2; chemische mutagenen, zoals ethyl methanesulfonate (EMS) of waterstofnitriet3; het gebruik van tijdelijke mutator stammen, zoals die over het uitdrukken van mutD5 4; en DNA schuifelen5.

Hier beschrijven we een omgekeerde-genetica strategie waarin we gebruik maken van foutgevoelige PCR voor het genereren van mutant zwembaden voor een doel-gen in de kernsplijting gist. Zoals men wel kan van de naam raden, genereert deze methode mutaties doordat opzettelijk fouten tijdens PCR. In tegenstelling tot andere methoden mutagenese kan foutgevoelige PCR de gebruiker te definiëren van de regio te worden mutagenized. Dit maakt het handig bij inspanningen om te bestuderen van de functie van een eiwit/domein van belang.

Om aan te tonen deze procedure willekeurige mutagenese, wij hierin rpt4 +, die de 19S proteasoom subeenheid codeert, als voorbeeld gebruiken. Rpt4 heeft aangetoond dat proteolyse-zelfstandige functies in organismen met uitzondering van kernsplijting gist6,7,8,9, en een defect in proteolyse indirecte effecten kan veroorzaken door een wijziging van de eiwitten niveaus. Wij, daarom gescreend voor mutanten die geactiveerd proteolyse-onafhankelijke veranderingen, met het doel van het onderzoek naar de functie van het proteasoom op heterochromatin.

Vergissing-geneigd PCR kan worden toegepast op elk gen-gebied door het afstemmen van de locatie waarop de primers binden. Mutanten die de gewenste fenotypische verandering vertonen kunnen worden geïdentificeerd met passende verslaggevers. Hier, we gebruikt een ade6 + verslaggever ingevoegd op de centromeer 1 buitenste herhaling (otr) regio10. Constitutieve heterochromatin wordt gevormd om deze regio11, zodat de ade6 + -verslaggever is het zwijgen opgelegd in de voorwaarde van de wild-type; Dit wordt aangegeven door rode kolonies10. Een mutatie die de constitutieve heterochromatin op de centromeer destabiliseert zal leiden tot de uitdrukking van de ade6 + verslaggever, die als witte kolonies is gevisualiseerd.

Protocol

1. voorbereiding van de Media Bereiden gistextract met supplementen (YES), ja zonder adenine (ja lage Ade), Pombe Glutamate medium (PMG12) en PMG zonder adenine (PMG-Ade) door het mengen van de componenten, zoals beschreven in tabel 1. Ja-Ade (lage Ade) en de PMG-Ade platen al dezelfde componenten, maar de adenine is weggelaten uit de laatste. Gebruik de volgende zout (50 x) voorraad: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2</s…

Representative Results

De verworven mutanten van het Rpt4 door het volgen van de procedures die worden beschreven in afbeelding 1 kunnen door de beoordeling van de kleuren van de kolonies worden geanalyseerd. De kleuren van de kolonies zijn bevlekt op de relevante platen in het verminderen van het aantal cellen in Figuur 2. De ade6 + verslaggever ingevoegd op de heterochromatin regio in wild-type het zwijgen is opgelegd en toont rode kolonies …

Discussion

Willekeurige mutagenese via foutgevoelige PCR is een krachtig hulpmiddel voor het genereren van een diverse pool van mutanten in een bepaalde regio. Deze techniek is vooral handig voor studies die willen beoordelen van de functie van een eiwit onder een specifieke omstandigheden. Bijvoorbeeld, gebruikt wij hierin foutgevoelige PCR ter beoordeling van de functie van de 19S proteasoom subeenheid, Rpt4, in heterochromatin onderhoud. Door het variëren van de regio gericht door de foutgevoelige PCR en aanpassing van de voorw…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiering van de steun voor dit project werd verstrekt door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (2016R1A2B2006354).

Materials

1. Media
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
Yeast extract BD Biosciences 212720
L-Leucine JUNSEI 87070-0310
Adenine sulfate ACR 16363-0250
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
L-Histidine Sigma-Aldrich H8125
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl JUNSEI 19015-0350
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Potassium phthalate Sigma-Aldrich P6758-500g
Inositol Sigma-Aldrich I7508-50G
Biotin Sigma-Aldrich B4501-100MG
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 Sigma-Aldrich M7634-500G
ZnSO4•7H2 JUNSEI 83060-031
FeCl2•4H2O KANTO CB8943686
Sodium molybdate dihydrate YAKURI 31621
KI JUNSEI 80090-0301
CuSO4•5H2O YAKURI 09605
D-myo-inositol MP biomedicals 102052
Pantothenate YAKURI 26003
Nicotinic Acid Sigma-Aldrich N4126-500G
(NH4)2SO4  Sigma-Aldrich A4418-100G
Agarose Biobasic D0012
G418, geneticin LPS G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aglient 600380 For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit Aglient 200500 For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F-530L For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase Takara RR001b For general PCR
BamH1 New England BioLabs R0136S
Xho1 New England BioLabs R0146S
Dpn1 New England BioLabs R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black VWR 89033-116 For replica
Replica-plating tool VWR 25395-380 For replica
MicroPulser Electroporator Biorad 1652100  For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap Biorad 1652086  For fission yeast transformation
Thermal Cycler Bioer BYQ6078 For fusion PCR ramp reaction 

References

  1. Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
  2. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  3. Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
  4. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  5. Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
  6. Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
  7. Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
  10. Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
  11. Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
  12. Forsburg, S. L. . Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , (2011).
  13. . . QIAquick PCR Purification Kit. , (2013).
  14. . . pBlueScript II Vector. , (2005).
  15. . . QIAquick Gel Extraction Kit. , (2013).
  16. . . QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , (2016).
  17. . . PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , (2004).
  18. . . Gibson Assembly Master Mix. , (2017).
  19. . . GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , (2012).
  20. . . Plasmid Plus Midi Kit. , (1999).
  21. Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  22. Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
  23. Nurse, P. . Fission Yeast Handbook. , (2000).
  24. Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
  25. Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
  26. Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
  27. Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).

Play Video

Cite This Article
Seo, H. D., Lee, D. Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast. J. Vis. Exp. (135), e57499, doi:10.3791/57499 (2018).

View Video