Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure
Summary
Cet article décrit une méthodologie détaillée pour la mutagénèse aléatoire d’un gène cible chez la levure. À titre d’exemple, nous ciblons rpt4 +, qui code une sous-unité du protéasome 19 s et écran pour les mutations qui déstabilisent l’hétérochromatine.
Abstract
Mutagenèse aléatoire d’un gène cible est couramment utilisée pour identifier les mutations qui donnent le phénotype souhaité. Des méthodes qui peuvent être utilisés pour réaliser la mutagénèse aléatoire, erreurs PCR est une stratégie pratique et efficace pour générer un bassin diversifié des mutants (i.e., une bibliothèque mutante). Erreurs PCR est la méthode de choix quand un chercheur veut muter une région prédéfinie, comme la région codante d’un gène tout en laissant les autres régions génomiques pas affectée. Après que la bibliothèque mutante est amplifiée par PCR sujette aux erreurs, il doit être cloné dans un plasmide approprié. La taille de la bibliothèque générée par PCR erreurs est limitée par l’efficacité de l’étape de clonage. Toutefois, dans la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, l’étape de clonage peut être remplacée par l’utilisation d’une fusion très efficace en une seule étape PCR pour générer des constructions pour la transformation. Mutants de phénotypes désirées peuvent sélectionner à l’aide de reporters appropriés. Nous décrivons ici cette stratégie en détail, par exemple, un journaliste inséré à l’hétérochromatine centromérique.
Introduction
La génétique vers l’avant est une méthode classique dans lequel chercheurs cherchent des mutants naturels qui présentent un phénotype particulier et effectuent des analyses génétiques. Dans la génétique inverse, les mutations sont introduites dans un gène d’intérêt et le phénotype est examiné. Dans ce dernier cas, la mutagénèse aléatoire d’un gène cible est souvent utilisé pour générer un groupe de mutants qui sont ensuite sélectionnés pour les phénotypes désirés, comme la sensibilité à la température ou modifié l’activité enzymatique. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour réaliser la mutagénèse aléatoire, y compris les erreurs PCR1; D’irradiation UV2; mutagènes chimiques, tels que le méthanesulfonate d’éthyle (EMS) ou l’acide nitreux3; l’utilisation de souches mutantes temporaire, telles que celles surexprimant mutD5 4; et ADN brassage5.
Nous décrivons ici une stratégie inverse-génétique dans laquelle nous utilisons Erreurs PCR pour générer des piscines mutantes d’un gène cible dans la levure de fission. Comme on pourrait le deviner de son nom, cette méthode génère des mutations en introduisant délibérément des erreurs pendant l’ACP. Contrairement aux autres méthodes de mutagenèse, erreurs PCR permet à l’utilisateur de définir la région à être mutagénisées tant. Ceci est particulièrement utile dans les efforts déployés pour étudier la fonction d’une protéine/domaine d’intérêt.
Pour illustrer cette procédure de mutagénèse aléatoire, dans les présentes utilisons-nous rpt4 +, qui code pour la sous-unité de protéasome 19 s, par exemple. Rpt4 a démontré avoir protéolyse indépendante des fonctions dans les organismes autres que fission levure6,7,8,9, et un défaut de protéolyse pourrait causer des effets indirects en altérant les protéines niveaux. Nous avons, par conséquent, projeté pour les mutants qui a déclenché les changements indépendants de protéolyse, dans le but d’étudier la fonction du protéasome sur hétérochromatine.
PCR erreurs peut être appliqué à n’importe quelle région du gène par le réglage de l’emplacement auquel lient les amorces. Mutants qui montrent le changement phénotypique souhaité peuvent être identifiés avec des journalistes appropriés. Ici, nous avons utilisé un journaliste ade6 + inséré au centromère 1 externe “répétition” (otr) région10. L’hétérochromatine constitutive est formé à cette région11, alors que le journaliste ade6 + est réduit au silence à l’état sauvage ; Ceci est indiqué par colonies rouges10. Une mutation qui déstabilise l’hétérochromatine constitutive au centromère donneront lieu à l’expression du reporter ade6 + qui est visualisée comme colonies blanches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenèse aléatoire via Erreurs PCR est un puissant outil pour générer un bassin diversifié de mutants dans une région donnée. Cette technique est particulièrement utile pour les études visant à évaluer la fonction d’une protéine dans une circonstance particulière. Par exemple, nous avons utilisé ici Erreurs PCR afin d’évaluer la fonction de la sous-unité de protéasome 19 s, Rpt4, dans l’entretien de l’hétérochromatine. En faisant varier la région ciblée par la PCR erreurs et ajuster les con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutien pour ce projet a été financé par le programme de recherche sciences fondamentales grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science et de la TIC (2016R1A2B2006354).
Materials
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
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