Summary

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Published: May 15, 2018
doi:

Summary

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

Abstract

Mutagenesi casuale di geni bersaglio è comunemente usata per identificare le mutazioni che producono il fenotipo desiderato. Dei metodi che possono essere utilizzati per raggiungere mutagenesi casuale, errori PCR è una strategia conveniente ed efficiente per la generazione di un pool di diverso mutanti (i. e., una libreria mutante). Errori PCR è il metodo di scelta quando un ricercatore cerca di mutare una regione pre-definita, come la regione di codificazione di un gene lasciando inalterato altre regioni genomiche. Dopo la libreria mutante è amplificata dalla PCR errori, deve essere clonato in un plasmide adatto. La dimensione della biblioteca generata da errori PCR è limitata dall’efficienza del passaggio clonazione. Tuttavia, il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe, il clonazione passo possa essere sostituito dall’uso di una fusione altamente efficiente One-Step PCR per generare costrutti per la trasformazione. Mutanti di fenotipi desiderati quindi sono selezionabili utilizzando appropriati ai giornalisti. Qui, descriviamo questa strategia in dettaglio, prendendo come esempio, un reporter inserito all’eterocromatina centromerica.

Introduction

Genetica in avanti è un metodo classico, in cui i ricercatori cercano mutanti naturali che visualizzano un fenotipo particolare ed eseguire analisi genetiche. In genetica inversa, mutazioni vengono introdotti in un gene di interesse ed il fenotipo è esaminato. In quest’ultimo caso, mutagenesi casuale di un gene target viene spesso utilizzata per generare un pool di mutanti che sono successivamente selezionato per desiderata fenotipi, come sensibilità di temperatura o alterati di attività enzimatica. Possono essere utilizzati vari metodi per raggiungere mutagenesi casuale, tra cui errori PCR1; Di irradiazione UV2; mutageni chimici, ad esempio methanesulfonate etilico (EMS) o acido nitroso3; l’uso di ceppi di mutator temporanei, come quelli che sovraesprimono mutD5 4; e DNA shuffling5.

Qui, descriviamo una strategia inversa-genetica in cui utilizziamo errori PCR per generare mutanti piscine per un gene dell’obiettivo del lievito di fissione. Come si potrebbe intuire dal suo nome, questo metodo genera mutazioni introducendo deliberatamente errori durante la PCR. A differenza di altri metodi di mutagenesi, errori PCR permette all’utente di definire la regione a essere mutagenizzato. Questo rende particolarmente utile negli sforzi per studiare la funzione di una proteina/dominio di interesse.

Per illustrare questa procedura di mutagenesi casuale, qui usiamo rpt4 +, che codifica per la subunità del proteasoma 19S, come un esempio. Rpt4 ha dimostrato di avere funzioni di proteolisi-indipendente negli organismi diversi da fissione lievito6,7,8,9, e un difetto nella proteolisi potrebbe causare effetti indiretti alterando proteine livelli. Abbiamo, quindi, sottoposti a screening per mutanti che ha attivato la proteolisi-indipendente modifiche, con l’obiettivo di indagare la funzione del proteasoma su eterocromatina.

Errori PCR può essere applicato a qualsiasi regione del gene regolando la posizione a cui associare il primer. Mutanti che presentano la variazione fenotipica desiderata possono essere identificati con i giornalisti appropriati. Qui, abbiamo utilizzato un reporter ade6 + inserito al centromero 1 esterno ripetere (otr) regione10. Eterocromatina costitutiva è formata a questa regione11, così il ade6 + reporter viene messo a tacere nella condizione di selvaggio-tipo; Questo è indicato da colonie rosse10. Una mutazione che destabilizza l’eterocromatina costitutiva al centromero porterà all’espressione del ade6 + reporter, che è visualizzato come colonie bianchi.

Protocol

1. preparazione dei Media Preparare Estratto di lievito con integratori (Sì), sì senza adenina (Sì basso Ade), Pombe Glutamate media (PMG12) e PMG senza adenina (PMG-Ade) mescolando i componenti come descritto nella tabella 1. Sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade hanno tutti gli stessi componenti, ma l’adenina è omesso da quest’ultimo. Utilizzare il seguente stock di sale (50x): 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2</su…

Representative Results

I mutanti di Rpt4 acquisiti seguendo le procedure descritte nella Figura 1 possono essere analizzati valutando i colori delle colonie. I colori delle colonie sono macchiati sulle piastre pertinenti nel fare diminuire il numero delle cellule nella Figura 2. Il reporter ade6 + inserito presso la regione di eterocromatina è messo a tacere nel selvaggio-tipo e Mostra colonie rosse in piastra sì-Ade. Una volta che l’eterocr…

Discussion

Mutagenesi casuale tramite PCR errori è un potente strumento per la generazione di un pool di diverso mutanti in una determinata regione. Questa tecnica è particolarmente utile per gli studi che cercano di valutare la funzione di una proteina in una circostanza specifica. Ad esempio, abbiamo utilizzato nel presente documento errori PCR per valutare la funzione della 19S proteasome subunità, Rpt4, nella manutenzione di eterocromatina. Variando la regione mirato dalla PCR errori e regolare le condizioni di selezione, si…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanziamento per questo progetto è stato fornito dal programma di ricerca di scienza base attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero delle scienze e TIC (2016R1A2B2006354).

Materials

1. Media
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
Yeast extract BD Biosciences 212720
L-Leucine JUNSEI 87070-0310
Adenine sulfate ACR 16363-0250
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
L-Histidine Sigma-Aldrich H8125
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl JUNSEI 19015-0350
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Potassium phthalate Sigma-Aldrich P6758-500g
Inositol Sigma-Aldrich I7508-50G
Biotin Sigma-Aldrich B4501-100MG
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 Sigma-Aldrich M7634-500G
ZnSO4•7H2 JUNSEI 83060-031
FeCl2•4H2O KANTO CB8943686
Sodium molybdate dihydrate YAKURI 31621
KI JUNSEI 80090-0301
CuSO4•5H2O YAKURI 09605
D-myo-inositol MP biomedicals 102052
Pantothenate YAKURI 26003
Nicotinic Acid Sigma-Aldrich N4126-500G
(NH4)2SO4  Sigma-Aldrich A4418-100G
Agarose Biobasic D0012
G418, geneticin LPS G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aglient 600380 For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit Aglient 200500 For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F-530L For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase Takara RR001b For general PCR
BamH1 New England BioLabs R0136S
Xho1 New England BioLabs R0146S
Dpn1 New England BioLabs R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black VWR 89033-116 For replica
Replica-plating tool VWR 25395-380 For replica
MicroPulser Electroporator Biorad 1652100  For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap Biorad 1652086  For fission yeast transformation
Thermal Cycler Bioer BYQ6078 For fusion PCR ramp reaction 

References

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Cite This Article
Seo, H. D., Lee, D. Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast. J. Vis. Exp. (135), e57499, doi:10.3791/57499 (2018).

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