Здесь мы представляем протокол для очистки exosomes из плазмы и сыворотки с сокращением Сопредседатель очистки белков крови не exosomal. Оптимизированный протокол включает ультрафильтрации, лечение протеазы и размер гель-проникающей хроматографии. Расширение очистки exosomes преимущества течению анализов, включая более точной количественной оценки везикулы и протеомных характеристика.
Exosomes, тип nanovesicle, освобожден от всех типов клеток, могут быть изолированы от любых телесных жидкости. Содержание exosomes, в том числе белков и РНК, являются уникальными для клетки, от которых они наследуются и может использоваться как показатели заболевания. Несколько общих протоколов обогащения, включая ultracentrifugation, выход exosomes, нагруженные белковых загрязнений. Конкретно мы нашли что самые обильные белков в крови часто совместно очищают с exosomes и может посрамить течению протеомических исследований, срыве выявление низкой изобилие биомаркера кандидатов. Дополнительную обеспокоенность является невоспроизводимость exosome белка количественной оценки из-за несовместимых представление уровня белка не exosomal. Чтобы удалить не exosomal белки, которые совместно очищают наряду с exosomes, добавление строгость в процессе очистки exosome был разработан протокол, подробно здесь. Пять методов были сопоставлены с помощью парных плазмы крови и сыворотки из пяти доноров. С помощью наночастиц, отслеживания, анализа и микро bicinchoninic кислоты белка пробирного анализа показали, что сводный протокол, используя ультрафильтрации и размер гель-проникающей хроматографии принесли оптимальный везикул обогащения и удаления растворимого белка. Западный blotting использовался для проверки, что ожидаемые обильные крови белков, в том числе альбумина и аполипопротеинов, были истощены.
Exosomes являются nanovesicles (размером от 30 Нм до 150 Нм) выпустила почти всех клеток в организме человека для облегчения связи в ячейке обрабатывает1,2. Интересно, что состав exosomes изменяется в зависимости от клетки происхождения, а также состояние здоровья отдельных3,4,5. Кроме того, exosomes могут быть получены из нескольких биологических жидкостей, таких как: слюна, моча и крови2. Из-за этих особенностей exosomes считаются хорошим источником болезни биомаркеров. К сожалению это не стандартный метод для изоляции exosomes. Некоторые лаборатории считают многоступенчатое центрифугирования, с последним высокоскоростной шагом на 100,000 x g с помощью градиентов плотности как метод золотой стандарт для exosome изоляции. Однако недавние исследования показали, что ultracentrifugation индуцирует агрегацию exosomes с растворимые белки и другие exosomes, в дополнение к затрагивающим целостность exosome, оба из которых могут препятствовать нисходящие приложения6,7 . Другие распространенные методы изоляции exosome включают, но не ограничиваются: количество осадков в коммерческих полиэтиленгликоля (PEG) на основе реагентов, центробежные ультрафильтрации и размер-гель-проникающей хроматографии (SEC). Коммерческих реактивов, с помощью полиэтиленгликоля (PEG) полимеров обогатить exosomes, заставляя их осадка и форма гранул. Ограничения, используя этот полимер являются загрязнение с остаточной PEG полимера и обилие растворимых не exosomal белков в конечный продукт. Ультрафильтрация использует центрифугирования для очищения и сконцентрировать пузырьки с помощью мембраны целлюлозы; exosomes сохраняются выше фильтр, в то время как меньше примесей и другие белки проходят через мембрану7,8. Так же, как другие методы центробежные ультрафильтрации имеет ограниченные возможности для очистки exosomes из-за сохранения высокого уровня не exosomal белков, белковых комплексов и агрегатов. Наконец SEC очистки использует пористых смолы для разделения молекул по размеру. SEC показал многообещающие результаты, преодоление большую часть проблем, возникших с другими методами, захватив часть загрязнений белков и сохранения целостности exosomal, так как изоляция основан на гравитации или низкого давления системы7, 9. Однако, Сопредседатель изоляции больше белка агрегатов и липопротеинов10 во время SEC влияет на чистоту подготовки окончательного exosome. Хотя некоторые методы были протестированы для exosome очистки от supernatants культуры клеток и плазмы7или только плазмы9,11, нет никакой информации о производительности методов прямого сопоставления крови плазмы и сыворотки от того же лица.
Здесь мы сосредоточены на очищение крови exosomes путем сравнения различных рабочих процессов, чтобы определить, если методы обогащения везикул переводимых между плазмой и сыворотки. Наночастицы, отслеживания, анализа и Западная помарка были использованы для количественного определения различий в составе концентрации, чистоты и белка exosome в конечных продуктах. Последний метод, подробно изложены в настоящем Протоколе, увеличение числа везикул и уменьшает уровни белка не exosomal. Важно отметить, что свидетельствует резкое сокращение общего совместного осаждения белков, включая альбумин и аполипопротеинов. Высокое обилие этих двух белков в крови и частота, с которой они совместно очищают с exosomes причины несоответствия между «очищенного» образцы, наклон вниз по течению анализы. Этот протокол включает в себя использование коммерчески доступных SEC смолы; смола состоит из пористых бусы, в которых меньше чем 700 кДа белками можно ввести бисер. Раз внутри, белки удерживаются octylamine лиганда. Элюата состоит из exosomes и больше чем 700 кДа12молекул. Кроме того для того, чтобы уменьшить белка агрегатов и аполипопротеинов, который уклониться от шарик треппинга, мы включать протеазы пищеварение шаг в рабочем процессе. В настоящее время не способен ни один метод максимального exosome доходности при одновременном снижении совместно очистки белков не exosomal. Это исследование показывает, что протокол очистки, который сочетает в себе протеазы пищеварение предварительной обработки с нескольких методов очистки и восстановления может использоваться для увеличения урожайности exosome и чистоты из сыворотки крови и плазмы.
Оптимизированный метод для повышения чистоты и доходность exosomes из крови будет увеличить способность точно шахта внеклеточного везикулы как источник биомаркеров для ряда заболеваний. Стандартные методы в настоящее время используется для изоляции exosomes, в частности, ultracentrifugation и методы…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано внутренних средств от CSU (чтобы КМД), ATCC контракт #2016-0550-0002 (субподряда NIAID HHSN272201600013C) и Фонд Билла и Мелинды Гейтс (OPP1039688) (КМД/НКГ). Мы благодарим NSF исследовательский опыт для студентов (REU) летняя программа в университете штата Колорадо для дополнительной поддержки.
Nanosight | Malvern | NS300 | |
Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
96 well plate | Corning | 15705-066 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |