עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטהר exosomes פלזמה והן בסרום בטהרה שיתוף מופחתת של חלבוני דם בלתי-exosomal. פרוטוקול ממוטבת כולל אולטראפילטרציה פרוטאז לטיפול, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. טיהור משופרת של exosomes הטבות במורד הזרם ניתוחים, לרבות כימות מדויקת יותר של שלפוחית ואפיון פרוטיאומיה מבנית.
Abstract
Exosomes, סוג של nanovesicle שוחררו כל סוגי תאים, יכול להיות מבודד בכל נוזלי. התכנים של exosomes, כולל חלבונים RNAs, הן ייחודיות על התאים שמהם הם נגזרים, יכול לשמש אינדיקטורים של המחלה. מספר פרוטוקולים העשרה נפוצות, כולל ultracentrifugation, תשואות exosomes עמוסות חלבון מסיס מזהמים. באופן ספציפי, מצאנו כי החלבונים הנפוץ ביותר בתוך דם לעיתים קרובות לטהר בשיתוף עם exosomes, יכולים לבלבל מחקרים פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם, שסיכל את הזיהוי של שפע נמוך סמן מועמדים. חשש נוסף הוא irreproducibility של exosome כמת חלבון עקב ייצוג לא עקבי של רמות החלבון הלא-exosomal. פרוטוקול מפורט כאן פותחה כדי להסיר חלבונים שאינם exosomal לטהר במשותף יחד עם exosomes, הוספת הקשיחות לתהליך טיהור exosome. חמש שיטות הושוו באמצעות לזווג פלזמה וסרום מתורמים חמש. ניתוח באמצעות ננו-חלקיק מעקב ניתוח ואת וזמינותו חלבון חומצה bicinchoninic מיקרו גילה כי פרוטוקול משולב ניצול כרומטוגרפיה הדרה אולטראפילטרציה וגודל הניב את שלפוחית אופטימלית העשרה והסרת חלבונים מסיסים. סופג המערבי שימש כדי לאמת החלבונים בדם שופע הצפוי, כולל אלבומין, apolipoproteins, היו דלה.
Introduction
Exosomes הם nanovesicles (החל בגודל של 30 ננומטר ל-150 ננומטר) שפורסמו על ידי כמעט כל התאים בגוף האדם כדי להקל על התקשורת לתא מעבד1,2. מעניין, ההרכב של exosomes משתנה בהתאם התאים של המקור, כמו גם מצב בריאותו של הפרט3,4,5. בנוסף, exosomes ניתן לאחזר מ נוזלים ביולוגיים כמה כגון: רוק, שתן, דם2. בשל תכונות אלה, exosomes נחשבים מקור טוב של סמנים למחלת. למרבה הצער, יש שיטה סטנדרטית עבור בידודו של exosomes. כמה מעבדות שקול צנטריפוגה רב-שלבי, בצעד מהיר הסופי ב g 100,000 x באמצעות מעברי צבע צפיפות כמו השיטה תקן הזהב exosome בידוד. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-ultracentrifugation הזה גורם צבירה של exosomes עם חלבונים מסיסים ו exosomes אחרים, בנוסף כדי להשפיע את exosome שלמות, אשר שניהם עשויים ה”בלתי יישומי הזרם6,7 . שיטות נפוצות אחרות של בידוד exosome כוללים, אך אינם מוגבלים: משקעים על ידי מסחרי פוליאתילן גליקול (PEG) מבוסס ריאגנטים אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות). ריאגנטים מסחרי באמצעות פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG) להעשיר exosomes על ידי גורם להם לזרז ויוצרים גלולה. מגבלות שימוש הפולימר הזה הם זיהום, עם פולימר פג שיורית, שפע של חלבונים מסיסים שאינם-exosomal במוצר הסופי. אולטראפילטרציה מנצל צנטריפוגה לטהר ולרכז שלפוחית באמצעות קרום תאית; exosomes נשמרים מעל המסנן, בזמן זיהומים קטנים וחלבונים אחרים עוברים הממברנה7,8. בדיוק כמו שיטות אחרות, אולטראפילטרציה צנטריפוגלי בעל קיבולת מוגבלת לטהר exosomes עקב השמירה של רמות גבוהות של חלבונים שאינם exosomal, כולל חלבון קומפלקסים אגרגטים. לבסוף, טיהור שניה משתמש שרף נקבובי כדי להפריד בין מולקולות לפי גודל. שניה הראתה תוצאות מבטיחות, להתגבר על רוב הבעיות מנוסה עם שיטות אחרות על-ידי לכידה הרוב המכריע של חלבונים מזהם של שמירה על שלמות exosomal, מאז בידוד מבוסס על כוח המשיכה או מערכות בלחץ נמוך7, 9. עם זאת, הבידוד שותף גדול יותר חלבון lipoproteins אגרגטים10 במהלך שניה משפיעה על הטוהר של הכנת exosome הסופי. בעוד כמה שיטות נבדקו לטיהור exosome supernatants התרבות תאים, פלזמה7, או רק פלזמה9,11, אין מידע על הביצועים של שיטות ישירות השוואת הדם פלזמה, סרום של אותו אדם.
כאן, אנו מתמקדים הטיהור של דם exosomes על-ידי השוואת מגוון של זרימות עבודה כדי לקבוע אם שלפוחית העשרה טכניקות לתרגום בין פלזמה לסרום. ננו-חלקיק מעקב אחר ניתוח תספיג שימשו כדי לכמת את ההבדלים בהרכב exosome, טוהר לריכוז החלבון במוצרי הקצה. שיטת הסופי, מפורט של פרוטוקול זה, מגביר את המספרים שלפוחית ומפחית רמות החלבון הלא-exosomal. חשוב, הפגינו ירידה דרסטית של חלבונים גורם משותף נפוץ כולל אלבומין, apolipoproteins. שפע גבוהה אלה שני חלבונים בדם ואת התדירות שבה הם שיתוף לטהר עם exosomes גורם חוסר עקביות בין דגימות “מזוכך”, הטיית הניתוחים במורד הזרם. פרוטוקול זה כולל את השימוש שרף שניה זמינים מסחרית; השרף מורכב חרוזים נקבובי שבו חלבונים קטנים יותר 700 kDa באפשרותך להזין את החרוזים. פעם אחת בפנים, החלבונים נשמרות על-ידי ליגנד octylamine. Eluate מורכב exosomes של מולקולות גדולות יותר מ 700 kDa12. בנוסף, על מנת להפחית את אגרגטים חלבון ואת apolipoproteins אשר להתחמק חרוז השמנה, אנו כוללים צעד עיכול פרוטאז בזרימת העבודה. כיום, אין שום טכניקה יחיד מסוגל למקסם את התשואה exosome תוך צמצום שיתוף טיהור החלבונים הלא-exosomal. מחקר זה מראה כי פרוטוקול טיהור המשלב רעלני עיכול של פרוטאז עם שחזור מרובים ושיטות טיהור יכול לשמש כדי להגדיל את התשואה exosome וטוהר נסיוב הדם, פלזמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה ממוטבת כדי להגביר את הטוהר ואת התשואה של exosomes מדם תגדיל את היכולת שלי במדויק שלפוחית חוץ-תאית כמקור של סמנים ביולוגיים עבור מחלות מספר. בשיטות הרגילות, המשמשים כעת כדי לבודד exosomes, ליתר דיוק, ultracentrifugation ושיטות משקעים, יש מספר חסרונות כולל צבירת exosome, pelleting של חלבונים מסיסים7<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרנות פנימי של CSU (כדי kmd ב), בקרת האוויר החוזה #2016-0550-0002 (קריעת של NIAID HHSN272201600013C), ו- ביל ומלינדה גייטס (OPP1039688) (כדי kmd ב/NKG). אנו מודים החוויה מחקר ה-NSF עבור תוכנית הקיץ סטודנטים (REU) באוניברסיטת קולורדו תמיכה נוספת.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
