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Bioengineering

Automatisierte Dia scannen und Segmentierung in Gewebekulturen beschriftet Gewebe mit einem Weitfeld High-Content Analysesystem

Published: May 03, 2018
doi:
10.3791/57440
, , , ,
1Department of Clinical Neurosciences, Arnie Charbonneau Cancer Institute,University of Calgary, 2Department of Cell Biology and Anatomy, Hotchkiss Brain Institute,University of Calgary, 3Department of Oncology, Hotchkiss Brain Institute,University of Calgary

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die automatische Segmentierung von eindringmittel beschrifteten Gewebe auf Folien mit einem Weitfeld-High-Content-Analyse-System (WHCAS). Dieses Protokoll hat breite Anwendungen in allen Bereichen umfasst die Quantifizierung der fluoreszierenden Marker in biologischen Geweben, einschließlich der biologischen Wissenschaften, Medizintechnik und Gesundheitswissenschaften.

Abstract

Automatisierte Dia scannen und Segmentierung der Gewebekulturen beschriftet Gewebe ist der effizienteste Weg, ganze Folien oder große Gewebeschnitten zu analysieren. Leider verbringen viele Forscher große Mengen an Zeit und Ressourcen, die Entwicklung und Optimierung von Arbeitsabläufen, die nur für ihre eigenen Experimente relevant sind. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll, das von Menschen mit Zugang zu einem Weitfeld-High-Content-Analyse-System (WHCAS) verwendet werden kann, zum Bild Folie montiert Gewebe, mit Optionen für die Anpassung in vorgefertigten Modulen in der zugehörigen Software gefunden. Nicht ursprünglich für Dia scannen, machen die in diesem Artikel beschriebenen Schritte es möglich, Dia Scannen von Bildern in der WHCAS, die in der zugehörigen Software importiert werden können zu erwerben. In diesem Beispiel die automatische Segmentierung des Gehirn Tumor Folien gezeigt, aber die automatisierte Segmentierung von jedem eindringmittel beschriftet nuklearen oder zytoplasmatischen Marker ist möglich. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von anderen quantitativen Softwaremodulen einschließlich Assays für Protein Lokalisierung/Translokation, zelluläre Proliferation/Tragfähigkeit/Apoptose und Angiogenese, die ausgeführt werden können. Diese Technik wird Forscher Zeit und Mühe sparen und erstellen Sie eine automatische Protokoll für Dia-Analyse.

Introduction

Die genaue und präzise Quantifizierung von eindringmittel beschriftet Gewebe auf Folien ist eine gefragte Technik in vielen Bereichen der Wissenschaft. Jedoch Forscher oft manuell zählen Exemplare oder verbringen Sie erhebliche Mengen an Zeit in die Entwicklung der esoterischen automatisierten Techniken, um dieses Ziel zu erreichen. Hier bieten wir ein Protokoll für die automatisierte Dia scannen und Quantifizierung von Zellen unter Verwendung einer WHCAS und der dazugehörigen Software mit angeborenen immunen Zellen in gefrorenen menschlichen Gehirn Tumor Abschnitte als Vorbild. Die zugehörige Software bietet eine breite Palette von integrierten anpassbaren Modulen von Neuriten Auswuchs zählen zu einer Differenzierung der Zelle Arten1,2,3,4,5, 6. das Ziel dieser Methode ist es, ein Start-Ziel, leicht reproduzierbar Protokoll zum Abrufen von Bildern der und quantitate eindringmittel beschriftet Entitäten in jede Folie montiert Gewebe Forscher bieten.

In diesem Protokoll dient der WHCAS vor allem für imaging-Platten für die nachfolgende Analyse auf der zugehörigen Software, obwohl eines diahalters und die Grundlagen zu Scan7 Rutschen zur Verfügung standen. Es war unerschwinglich, Bildfolien, die sorgfältige räumlichen Kalibrierung Bereich Akquisition, die Auswahl der entsprechenden Zeitschriften, die Erstellung von maßgeschneiderten Loadouts und eine Liaison mit Produkt-Vertreter waren erforderlich. Im breiteren Körper der Literatur statt Kauf eines dedizierten Dia-Bildgebung und Analyse Apparat8umgangen ein früheren technischen Bericht mit Zugriff auf diese Software die Bildaufnahme der Folien auf den WHCAS insgesamt9. Durchführung von Bildanalyse Erwerb oder ein Bild auf verschiedenen Plattformen erfordert zusätzliche Arbeit um sicherzustellen, dass jeder mit dem anderen vereinbar ist.

Die Möglichkeit, die WHCAS und die zugehörige Software für Bilderfassung verwenden würde die unnötige Komplikationen suchen oder entwickeln eine Workflow Alien auf diese Tools vermeiden. In diesem Artikel die Schritte erforderlich, um ein schwacher Vergrößerung Übersicht Scan und die entsprechende hohe Vergrößerung Bilder erstellen, indem Sie die Folie als eine Platte zu behandeln, und die nachfolgenden Analysen mit Hilfe des Multi-Wellenlänge Zelle Scoring Segmentierung Moduls ermöglichen die Wiederverwendung von den WHCAS. Dieses leicht verwendbare Protokoll bietet einen Vorteil gegenüber alternativen Techniken, denn es gibt keine Notwendigkeit, Algorithmen oder mehrstufigen zählen Protokolle10,11 zu entwickeln, sobald die Bilder auf der WHCAS erworben werden. Dieses Protokoll verringert den Zeitaufwand für eine Quantifizierung Technik zu optimieren, ist eine präzisere12 und effizienter als das manuelle Zählung und maximiert die Nutzung der WHCAS. Dieses Protokoll kann weit verbreitet und leicht verwendet werden, da es die Bildgebung und Analyse von jedem eindringmittel beschriftet Gewebe auf Folien ermöglicht.

Protocol

Tumor Proben wurden entsprechend dem Protokoll von der lokalen institutionellen Board und Ethik Prüfungsausschuss genehmigt und im Einklang mit nationalen Vorschriften erhalten. Die WHCAS und die dazugehörige Software in diesem Artikel verwendeten finden Sie in der Tabelle der Materialien. 1. importieren die Zeitschriften Öffnen Sie die zugehörige Software. Laden Sie die Journal-Suite in der Tabelle der Materialienangegeben. Die Journal-Suite in ein geeignetes Verzeichnis durch Anklicken im Hauptmenü Rubrik Journal, importieren Sie Import Journal Suite…auswählen, und auf Import. 2. Erstellen von Einstellungen für die Vorschau Scannen Erwerb Gehen Sie im Dialogfeld Platte Erwerb Setup in die Objektive und Kamera Registerkarte Wählen Sie 4 X als die Vergrößerung, als die Kamera binning 1 und 2 als der Gewinn. Geben Sie die Einstellungen in Figur 1A unter der Registerkarte ” Platte – Slidescanning.Hinweis: Diese Einstellungen sind entstanden, damit der Benutzer anzeigen und bis zu 3 Folien navigieren. Jede Folie ist unterteilt in 3 benachbarten Vertiefungen für die einfache Navigation und Visualisierung der Scheiben Gewebe oder Zellen “live”. Füllen Sie auf der Registerkarte Websites zu besuchen die Vertiefungen gleichmäßig mit den Standorten. Klicken Sie auf Platte unten Einstellungen bearbeiten… und geben Sie die Werte in Abbildung 1 bangezeigt. Auf der Registerkarte Erwerb Schleife geben Sie die gewünschte Wellenlänge (nukleare Fleck in diesem Beispiel) für die Vorschau-Scan. Verwenden Sie für den besten Kontrast und bildbasierten konzentrieren die hellsten Fluoreszenzsignal (z.B. oft eine nukleare Fleck).Hinweis: Färbung Gewebe mit einem hellen Fleck wie eine nukleare Fleck wird empfohlen, da dies einen hohen Kontrast im Vergleich zum Hintergrund bietet. Nicht nur wird diese Hilfe in der Probe-Lage, aber wenn mehr als ein Fluorophor in folgenden hoher Vergrößerung mit dem imaging, die hellste Farbe wird verwendet, um den imaging Offset der anderen Farben basieren. Shading-Korrektur bei Platte Akquisitionsmodus zum Zusammenfügen von Bildern zu ermöglichen. Speichern Sie diese Einstellungen als Einstellung A. 3. Erstellen Einstellungen für Folie Erwerb bei hoher Vergrößerung Gehen Sie im Dialogfeld Platte Erwerb Setup in die Objektive und Kamera Registerkarte Wählen Sie 40 X als die Vergrößerung, als die Kamera binning (für die höchste digitale Auflösung) 1 und 2 als die Verstärkung (um das Signal und die Helligkeit der Bilder zu erhöhen).Hinweis: Eine niedrigere Vergrößerungseinstellung für Objektive kann verwendet werden, aber die Autoren gefunden 40 X die optimale Einstellung für die Analyse der menschlichen Mikroglia und Makrophagen im Gehirn Tumorgewebe mit dem Multi-Wellenlänge Zelle Scoring -Modul sein. Alle Einstellungen für die Registerkarten ” Platte – Slidescanning und Platte unten Einstellungen bearbeiten… ” identisch mit dem Setting A sind zu gewährleisten (siehe Schritt 2). Wenn die Bilder nicht knusprig sind, ändern Sie die gesunde Tiefe, Traufhöheund Platte unten Einstellungen , um den Fokus einzustellen. Wenn es noch ein Problem mit dem Fokus immer, wählen Sie Laser mit Image Recovery unter Abschnitt Autofokus-Optionen . Geben Sie auf der Registerkarte Erwerb Schleife die Anzahl der Wellenlängen in der Probe vorhanden. Aktivieren Sie die Aktivieren Sie Laser-basierten Fokussierung und bildbasierten Fokussierung (für Erwerb oder Laser-Wiederherstellung) Optionen. Wählen Sie unter der Registerkarte ” Autofokus ” Fokus auf Teller legen und gut unten. Wählen Sie in der Registerkarte ” Zeitschriften ” die Optionen, wie in Abbildung 2, sicherzustellen, dass Verhütung asynchrone Hardware bewegt sich auch ausgewählt ist. Speichern Sie diese Einstellungen als Einstellung B. 4. platzieren die Folie in das Weitfeld High-Content-Analyse-System Drücken Sie F4 , um das Hauptmenüzu erhalten. Wählen Sie die Folie, Scannen. Klicken Sie auf Open Door-Auswerfen Dia und einsetzen Sie Dias und den Diahalter (das bis zu drei Folien halten kann) in der WHCAS (Abb. 3A und 3 b). Richten Sie die Folie mit dem Deckglas nach unten und das Etikett auf der Seite der Kerbe in den Diahalter (Abb. 3A).Hinweis: Die Folien in diesem Experiment verwendet wurden standard 25 x 75 x 1-mm-Dias. Klicken Sie auf enge Tür – Dia laden. 5. Erwerb eine Vorschau-Scan Wählen Sie unter der Rubrik Screening Platte Erfassung und Steuerung… und Platte Erwerb Setup aus… und laden Sie Einstellung A. Unter der Registerkarte ” Wells auf Besuch “, die gut mit der Probe, mit der Rechte Maustaste auf die Maus zu bewegen. Unter der Registerkarte Websites zu besuchen an verschiedenen Standorten mit der Live -Bilderfassung verschieben Sie, bis die Zellen befinden. Manuell fokussieren auf die Probe oder der Autofokus. Verwenden Sie Snap , um das Bild zu erfassen.Hinweis: Die Probe ist einfacher, mit mehr Seiten und durch den Einbau der Websites, die gut zu finden (siehe Punkt 2.3). Wählen Sie im Hauptmenü Vorschau gleitet. Wählen Sie im Dialogfeld, das sich automatisch öffnet die Option nachdenken, wieviele DIAS gescannt werden sollen. Scannen Sie eine Folie zu einem Zeitpunkt. Drücken Sie “OK”. Wählen Sie 4 X als die Vergrößerung. Drücken Sie “OK”. Wählen Sie Deckglas (0,17 mm) als die Folie Ausrichtung (verwenden Sie eine Korrektur am Kragen, wenn verschiedene Deckglas Dicke verwendet wird). Drücken Sie “OK”. Klicken Sie auf weiter.Hinweis: Wenn der Benutzer Vorschau-Scans für 2 oder mehr Folien erwerben will, muss jede Vorschau-Scan vor dem Erwerb des entsprechenden hoher Vergrößerung Bildes einzeln geöffnet werden. Sicherzustellen Sie unter Last Scan schieben Einstellung, dass die Übernahme Einstellungen und Kalibrierungen Kontrollkästchen aktiviert sind. Drücken Sie Abbrechen. Wenn Feld Scan-Dia-Einstellungen erneut angezeigt wird, wählen Sie fortfahren. Wenn das Dia scannen -Dialogfeld angezeigt wird, passen Sie die Einstellungen wie in Abbildung 4A-4 Cvorgeschlagen. Wählen Sie Schließen Wenn Sie fertig sind.Hinweis: Erhöhung der Kamera binning und verringern die Belichtungszeit der Kamera führt in schnelleres Scannen, wenn auch zu einem niedrigeren digitale Auflösung und Dynamikumfang, bzw. damit die Bildqualität verringert. Shading-Korrektur sorgt für eine gleichmäßige Intensität über einen einzigen Sichtfeld. Einschalten Hardware und Bild Autofokus sorgt für der Scan steht im Mittelpunkt, sondern verlangsamt das Scannen. Im Interesse der Zeit zu sparen, empfiehlt es sich, Shading Korrektur und Hardware Bild Autofokus ausschalten bei geringer Vergrößerung-Scan zu erwerben, sondern diese Optionen haben für Schritt 6 bei hoher Vergrößerung Bildgebung eingeschaltet. Die Auflösung des Scans geringer Vergrößerung beeinträchtigt nicht die hohe Vergrößerung Scan-Auflösung. Wählen Sie ein Verzeichnis für das Dia Scannen von Daten. Klicken Sie auf “OK”. Geben Sie einen Namen für die Datei. Klicken Sie auf “OK”. Im Bereich zeichnen Dialogfeld wird automatisch angezeigt. Verwenden Sie das rechteckigen Bereich Werkzeug (Abb. 5A), um den gesamten Vorschaubereich Scan wie in Abbildung 5 bauszuwählen. Klicken Sie auf weiter. Das Komplette Setup Dialogfeld wird angezeigt. Wählen Sie weiter.Hinweis: Die Vorschau-Dia-Scan beginnt jetzt. Wenn die Vorschau abgeschlossen ist, wird der Vollständige Scan- Dialogfeld angezeigt. Wählen Sie weiter. Schließen Sie die Vorschau-Scan-Fenster nicht (in diesem Beispiel das DAPI Scan -Fenster; siehe Abbildung 6).Hinweis: Das Setup und geringer Vergrößerung Scan Akquisitionsprozess dauert ca. 20 Minuten. Die anschließende hohe Vergrößerung Bild Erfassungszeit hängt von der Anzahl der Standorte sowie die Belichtungszeiten für jeden Kanal gewählt. 6. hohe Vergrößerung Scannen Laden Einrichtung B. Legen Sie fest, welche Brunnen abgebildet werden. Unter der Registerkarte ” Wells auf Besuch “, die gut mit der Probe, mit der Rechte Maustaste auf die Maus zu bewegen.Hinweis: Die Technik ist hier durch bildgebende gut 1 demonstriert. Unter der Registerkarte Websites zu besuchen an verschiedenen Standorten mit der Live -Funktion verschieben Sie, bis die Zellen oder Gewebe befindet. Manuell fokussieren auf die Probe oder der Autofokus. Verwenden Sie Snap , um das Bild zu erfassen.Hinweis: Zur Unterstützung bei der Suche nach der Probe bei hoher Vergrößerung, verwenden Sie das Dialogfeld Platte Übernahme und Kontrolle anpassen die Schrittgröße überall von 5 bis 100 µm, die Probe zu finden, wenn Autofokus nicht. Klicken Sie unter der Registerkarte ” W1 DAPI ” Auto verfügbar zu machen. Sicherstellen Sie, dass die Platte Erwerb Snap – DAPI Bild ist knackig. Klicken Sie unter dem Hauptmenü auf Journal , das Pulldown-Menü zu offenbaren. Wählen Sie ausführen… Journal. Doppelklicken Sie auf das Schieben Region Erwerb Setup -Journal um es zu starten. Wenn das Setup schieben Region Erwerb -Dialogfeld angezeigt wird, wählen Sie fortfahren. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie richtig das DAPI Scannen , das niedrig-Vergrößerung Folienbild auswählen. Drücken Sie “OK”. Ähnlicher Weise hervorheben Sie, die Platte Erwerb Snap – DAPI gefragt, für die Platte Erwerb Snap. Klicken Sie auf “OK”. Wenn das erstellen “oder” Last Regionen angezeigt wird, verwenden Sie das Tool rechteckigen Bereich auswählen (a) Region(en) Verzinsung der DAPI-Scan (Abbildung 6). Drücken Sie weiter.Hinweis: Die maximale Fläche, die bei 40 X ausgewählt werden kann ist 45 Spalten mal 35 Zeilen. Wenn mehrere Regionen von Interesse ausgewählt sind, werden der Regionen an die Box mit der größten Fläche verkleinert. Die Boxen können nach der Größenänderung neu positioniert werden. Wählen Sie Nein unter Last Regionen -Dialogfeld.Hinweis: Die Auswahl Ja gespeicherte Lasten zuvor Regionen für Stapel von Folien mit der gleichen Region von Orten von Interesse. Mit dem Locator -Werkzeug markieren Sie die größte Region des Interesses zu und drücken Sie weiter unter im Dialogfeld Wählen Sie Region . Wenn Feld Confirm Regionen angezeigt wird, wählen Sie fortfahren. Entscheiden Sie, ob die Region muss gespeichert werden, wenn die Regionen speichern -Dialogfeld angezeigt wird. Im Dialogfeld Website Abstand, ermöglicht dem Benutzer, gekachelt, wählen die Ergebnisse in ein Bild ohne Überlappung oder 10 % überlappen. Wählen Sie eine Option und klicken Sie auf “OK”. Die Autoren wählten gekachelt. Drei Dialogfelder werden nun angezeigt. Die Komplette Setup Box kann entlassen werden, mit weiter. Schließen Sie die Akquisition Site-Setup für 40 X -Box (Abb. 7A) noch nicht da es deutlich, wie viele Spalten macht und Zeilen müssen in die Platte Erwerb Setup -Box (Abb. 7 b) eingegeben werden. Halten Sie das WellPositions -Feld (Abbildung 7), das erscheint in der unteren linken Ecke offen für die Dauer der Bildgebung. Im Feld Platte Erwerb Setup unter Brunnen zu besuchen, muss die gleiche Anzahl von Brunnen wie Regionen von Interesse, die zuvor ausgewählt werden hervorgehoben (Abbildung 7).Hinweis: Die Autoren entwickelt dieses Protokoll für maximal neun Regionen von Interesse pro Folie. Wenn es mehr gibt, erhöhen Sie einfach die Anzahl der Spalten oder Zeilen in der Registerkarte ” Platte – SlideScanning “, entsprechend die Zahl der Regionen von Interesse. Diese Brunnen nicht räumlich stellen die Position der Regionen von Interesse in irgendeiner Weise muss, die entsprechende Anzahl jedoch hervorgehoben (Linksklick). Die Platte Erwerb Setup gehen Sie auf die Registerkarte ” Seiten auf Besuch ” geben Sie im Feld die vorgeschlagenen Spalten und Zeilen (Abb. 7 b). Denken Sie daran, Tile Seitenanklicken. Um das Rätselraten zu finden, die Seiten mit der Probe zu entfernen, drücken Sie Erwerben Platte unter der Registerkarte ” Zusammenfassung ” auf die Bühne an der vorgewählten Region des Interesses zu positionieren. Sobald die Kamera über eine Website schwenkt, die Zellen enthält, drücken Sie Abbrechen in der rechten unteren Ecke die Bildaufnahme zu stoppen. Stellen Sie sicher, die Bühne ist jetzt über der Probe gelegen. Optimieren Sie die Wellenlänge-Einstellungen, um sicherzustellen, dass eine gezielte und ein hoher Dynamikbereich Bild ergibt sich. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf die Registerkarte ” Zusammenfassung ” und Erwerben Platte. 7. die Bildanalyse Wählen Sie die gewünschten benutzerdefinierten Modul.Hinweis: Die Autoren wählten Moduls Multi-Wellenlänge Scoring-Zelle , eine automatische Segmentierung der Gehirn-Tumor-Folien zu demonstrieren. Führen Sie die Analyse auf allen Seiten. Wenn die Analyseparameter für viele Folien gleich sind, kann die Analyse im Feld Platte Erwerb Setup unter der Registerkarte ” Post Acquisition ” enthalten. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, schließen Sie alle Websites der schlechten Bildqualität um nicht die Ergebnisse verzerren. Da das Ziel dieser Analyse ist, Mikroglia und Makrophagen in der Tumor-Parenchym zu quantifizieren, wählen Sie die Region von Interesse innerhalb der tumorprobe Kanten. Darüber hinaus schließen Sie die Websites, die unscharf sind und/oder Gewebe Falten oder Bläschen und Risse im Gewebe enthalten. Sehen Sie für eine Demonstration die Vertreter Ergebnisse. Alternativ verwenden Sie die Laser Fokus Partitur erzeugt für jeden Standort abhängig von der Amplitude der Laser Reflexion als Schwellenwert unten welche Seiten sollen ausgeschlossen werden (die Schwelle ist individuell und abhängig von Parametern wie z. B. die Belichtungszeit und die Typ der verwendeten Medien).Hinweis: Die hohe Vergrößerung Bilder machen es möglich, speziell Strukturen wie große Blutgefäße und Bereiche der Nekrose, ggf. auszuschließen. Es ist auch möglich, nur Bereiche von Interesse, wie diejenigen enthalten, die hyperzelluläres sind. Auf diese Weise können die Spezifität und Genauigkeit der Analysen erhöht werden.

Representative Results

Die Bilder können in der WHCAS-Software angezeigt werden. Abbildung 8 zeigt die hohe Vergrößerung Miniaturen aller Seiten innerhalb der definierten Region von Interesse. Überprüfen Sie jede Website um diejenigen zu identifizieren, die aus der Analyse ausgeschlossen werden sollen (Beispiele sind bzw. bei niedrigen und hohen Vergrößerung in Abbildung 8 und Abbildung 9gezeigt). Zum Beispiel ist unscharf (Abbildung 9A), Seite 149, Seite 219 hat Bläschen (Abbildung 9 b) und Seite 54 enthält eine Falte (Abbildung 9) und sollten ausgeschlossen werden. Es ist typisch für 10-15 % aller Websites abgebildet auszuschließen. In dem gegebenen Beispiel waren 15,3 % der Websites ausgeschlossen (25/300 hatte Bläschen, 17/300 waren unscharf, 3/300 wurden gefaltet und 1/300 wurde am Rand). Abbildung 10A ist ein repräsentatives Bild für Analyse (die entsprechende Miniaturansicht geringer Vergrößerung ist in Abbildung 8dargestellt) gewählt. Hier die entsprechenden Überlagerungen durch das Multi-Wellenlänge Zelle Scoring-Modul generiert zeigen die Ergebnisse der automatischen Segmentierung auf Seite 59, angepasst an die Autoren Spezifikationen durchgeführt (Mindestbreite Kerne = 2,5 µm, maximale Breite = 7,5 µm und Intensität über lokalen Hintergrund = 35 Graylevels; CD11b-positiven Zellen Mindestbreite = 4 µm, maximale Breite = 18 µm, minimale Bereich gebeizt = 15 µm2und Intensität über lokalen Hintergrund = 310 Graylevels; und CD45-positiven Zellen Mindestbreite = 4 µm, maximale Breite = 18 µm, minimale Bereich gebeizt = 15 µm2und Intensität über lokalen Hintergrund = 50 Graylevels). Nach der Segmentierung, die quantitativen Daten über den Anteil der Zellen Färbung positiv für jede Markierung (6,2 ± 5,1 % und 3,8 ± 2,1 % des CD11b+ und CD45+ Zellen, beziehungsweise), beide Marker (3,5 ± 2,1 % CD11b+CD45+ Zellen), keine Markierungen (86,6 ± 9,0 % CD11b–CD45– Zellen; Abb. 10 b), mittlere Bereich gebeizt (40,0 ± 9,2 µm und 36,7 ± 7,6 µm von CD11b+ und CD45+ Zellen; Abbildung 10), und meine Fluoreszenzintensität (408,9 ± 40,3 relative Fluoreszenz und 373,9 ± 38,1-relative Fluoreszenz-Einheiten von CD11b+ und CD45+ Zellen; Abbildung 10) erhalten Sie. Abb. 1: Einstellungen für Folie Erwerb bei kleiner Vergrößerung. A. dieses Bild zeigt die Platte-Einstellungen. B. hier die Platte unten Einstellungen werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Einstellungen für Folie Erwerb bei hoher Vergrößerung. Diese Abbildung zeigt die Auswahl der entsprechenden Zeitschriften. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Demonstration, wie Folien mit den Diahalter laden. A. die Folie befindet sich Deckglas nach unten mit der Bezeichnung auf der Seite der Folie Adapter Kerbe. B. der Diahalter in die Weitfeld-High-Content-Analyse-System geladen wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Folie Vorschaueinstellungen. A. diese Abbildung zeigt die Parameter für den Erwerb. B. hier die Werte für die Hoechst/DAPI-Wellenlänge-Einstellungen werden angezeigt. C. dieses Bild zeigt die Journal-Einstellungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Zeichnung einer Folie Region. A. Werkzeugs rechteckigen Bereich (andere Zeichenwerkzeuge können nicht verwendet werden) wird verwendet, um wählen den Vorschau-Scan-Bereich und Regionen von Interesse auf dem DAPI-Scan zu erstellen. B. / Petrol Gliederung in dieser Abbildung zeigt, wie das gesamte Gebiet der Folie (einschließlich des Etiketts) ausgewählt werden soll. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6: Regionen von Interesse auf den Vorschau-Scan erstellen. Die Vorschau bzw. DAPI Scan stellt den gesamten Folienbereich. In diesem Beispiel gibt es drei seriellen Gehirn Gewebeschnitte (die feste weiße rechteckige Umrisse). Der Bereich oberhalb dieser Bereiche stellt die Runden Etiketten auf der Folie. Anderen Abschnitt Regelung schränkt nicht die anschließende Auswahl der Regionen von Interesse. Die Region von Interesse in diesem Beispiel wird mit einem gestrichelten weißen rechteckigen Umriss angezeigt. Die Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7: wesentliche Fenster für hohe Vergrößerung Bild Erwerb. A. Erwerb Seite Setup-Fenster wird angezeigt, wie viele Spalten und Zeilen innerhalb der Region(en) von Interesse sind. B. gewährleisten die richtige Anzahl von Spalten und Zeilen in Abbildung 7A angegeben werden in die Platte Erwerb Setup-Box eingegeben und die Seiten sind gefliest. C. es ist notwendig, das WellPositions Fenster für die Dauer der Bildaufnahme offen zu halten, auch wenn es leer ist. D. muss die entsprechende Anzahl von Regionen von Interesse hervorgehoben werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8: repräsentatives Bild von der Region von Interesse. Jede Website kann in einer zusammengesetzten Miniaturansicht der Region von Interesse angezeigt werden. Die repräsentativen Websites, die ausgeschlossen wurden (markiert mit roten Kästchen) und ein Beispiel für eine inklusive Website (gekennzeichnet durch ein grünes Feld) wird bei einer höheren Vergrößerung angezeigt. Es wird empfohlen, jede Website, um sicherzustellen, dass es von ausreichender Qualität für die Analyse ist zu überprüfen. Die Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9: Beispiele von Websites, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollen. A. das menschliche Gehirn Tumor Abschnitte wurden gefärbt mit CD11b (grün) und CD45 (rot), Marker der Mikroglia und Makrophagen. Dieses Bild ist unscharf und wurde aus der Analyse ausgeschlossen. B. Bubbles sind in diesem Bild, das aus der letzten Analyse ausgeschlossen wurde. C. Diese Seite wurde wegen der Falte im Gewebe von der Analyse ausgeschlossen. Der Maßstabsbalken sind 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 10: Repräsentative Bilder und Analyse. A. jedes Bild erscheint neben der Überlagerungen, die Ergebnisse der automatischen Segmentierung darstellt. In der Überlagerung Kerne werden in weiß angezeigt und positiv gefärbten Zellen sind für CD11b und rot für CD45 in grün dargestellt. Mit Ausnahme der Websites von ungenügender Qualität aus der Analyse und Kombination der Ergebnisse aller übrigen Websites, B. die durchschnittlichen Anteile der die Gesamtzahl der Zellen an jedem Standort, die positiv für jede Markierung gebeizt und Co für beide Marker Cgekennzeichnet. die durchschnittliche gefärbten Bereich und D. die durchschnittliche Zelle Intensität werden grafisch dargestellt. RFU = relative Fluoreszenz-Einheiten. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Der Maßstabsbalken sind 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Eine gemeinsames Problem noch behindern die Effizienz der biologischen Wissenschaftsforschung ist die Entwicklung von Protokollen für die unvoreingenommene, genaue und präzise Quantifizierung von eindringmittel beschriftet Gewebe und ihre Strukturen. Erhebliche Mengen an Zeit und Mühe richten sich auf Wege, Gewebe, Folien zu analysieren, sobald sie abgebildet worden sind. Viele bestehende Methoden bieten Algorithmen für Benutzer innerhalb von Programmen12,13,14neu zu erstellen. Diese Methoden sind akzeptabel, aber die Bedeutung dieses Berichts ist, dass es dem Benutzer ermöglicht, schnell und einfach zu etablieren eine ganzheitliche Bildaufnahme und Analyse Protokoll besitzt der Benutzer Zugriff auf eine WHCAS. Assays, die Zelltypen differenzieren und quantifizieren mehrere Strukturen und Prozesse, Zellzyklus Analyse und nukleare Translokation, zum Beispiel, gibt es bereits in der zugehörigen Software.

Das Setup beinhaltet einige wichtige Schritte. Erstens sind die räumliche Parameter der Folie definiert, als wäre es eine Platte. Zweitens entsteht ein geringer Vergrößerung Übersicht Scan aus der Regionen von Interesse für die hohe Vergrößerung Bildgebung ausgewählt werden. Zu guter Letzt sind Websites, die Einfluss auf die Genauigkeit und Präzision der nachfolgenden Analysen ausgeschlossen. Die größte Einschränkung dieser Technik ist, dass seine Anwendbarkeit hängt, wenn der Benutzer Zugriff auf eine WHCAS hat. Jedoch stellen mit dem wachsenden Bedarf für High-Content-Analyse-Systeme, viele Institutionen an ihre Forscher weiterhin wettbewerbsfähig15zur Verfügung. Fehlerbehebung ist meist erforderlich, wenn Gewebeschnitte nicht die gleiche Dicke haben. Wenn mehrere Regionen von Interesse ausgewählt sind, werden einige im Fokus, während andere nicht. Im Idealfall beim Schneiden, würde der Benutzer kümmern, um homogenere Proben zu schaffen. Allerdings sollten die Proben nicht übereinstimmen, können der Fokus auf die nukleare Fleck Wellenlänge (oder des Benutzers hellsten Fluorophor), derer zu konzentrieren, nachgestellt werden für jede Out-of-Focus-Region von Interesse und sogar für jedes Sichtfeld. Wie die anderen Wellenlängen vom nuklearen Fleck Wellenlänge einfach versetzt sind, braucht nur diese Wellenlänge nachjustieren.

In diesem Bericht zeigen wir wie Sie scannen und analysieren Dias mit Hilfe eines WHCAS und die dazugehörige Software. Das Multi-Wellenlänge Zelle Scoring-Modul ermöglicht dem Benutzer automatisch alle nuklearen oder zytoplasmatischen Marker zählen, die eindringmittel gekennzeichnet sind. Nach dem Einstellen des Fokus-Einstellungen und definieren die zellulären Eigenschaften wie Breite und Fläche des Moduls an das Gewebe abgebildet anpassen, ist keine weitere Notwendigkeit Eingreifen des Benutzers, die abgebildeten Folien und quantitative Daten zu erhalten. Bis zu drei Folien gleichzeitig abgebildet werden kann und mehrere Regionen von Interesse können definiert werden. Mit diesem Protokoll können WHCAS Benutzer, die Folien zu analysieren müssen anpassbar, Mehrzweck, nutzen automatisierte Workflows, die wenig bis gar keine Optimierung erfordern und können in alle Projekte in der Zukunft, bei denen der histologischen Untersuchung des Gewebes eingesetzt werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss von der Canadian Institutes of Health Research und Alberta innoviert – Health Lösungen/Alberta Cancer Foundation finanziert. Die Autoren wollen Referats Regeneration in Neurobiologie zentrale Einrichtung für die Nutzung von Bürogeräten, die Arbeit von Paula Gedraitis im Gebäude der Stiftung auf der Dia scannen auf der WHCAS möglich gemacht wurde, und der Schöpfer der Produkte bestätigen in diesem Artikel, Molekulare Geräte erwähnt.

Materials

ImageXpress MicroXLS Molecular Devices NA Apparatus for image acquisition
MetaXpress 5.1 Molecular Devices NA Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system).
Slide adapter Molecular Devices NA Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp Molecular Devices NA The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative
Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL Molecular Devices NA Select this journal in Step 6.6.
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References

  1. Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
  2. Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
  3. Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
  4. Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
  5. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
  6. Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
  7. Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
  8. Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer’s disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
  9. Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
  10. Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
  11. Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
  12. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
  13. Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
  14. Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).

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Poon, C. C., Ebacher, V., Liu, K., Yong, V. W., Kelly, J. J. P. Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System. J. Vis. Exp. (135), e57440, doi:10.3791/57440 (2018).
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