自動スライド スキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション

腫瘍の標本は、ローカル施設内審査委員会および倫理委員会で承認された各国の規制に従って実施プロトコルに従って得られました。WHCAS とその関連ソフトウェアのこの記事で使用の材料表のとおりです。 1. 仕訳帳をインポートします。 関連付けられたソフトウェアを開きます。 材料の表に示されているジャーナル スイートをダウンロードします。 メイン メニューのジャーナルの見出しをクリックして、適切なディレクトリにジャーナル スイートをインポートインポート仕訳帳スイート…を選択し、インポートをクリックします。 2. 作成の設定プレビュー スキャン取得 プレート獲得のセットアップ] ダイアログ ボックスでに行く目的とカメラ] タブ [4 X 倍率、カメラのビニングとして 1 と 2 のゲインとして。 図 1 aにタブ板-Slidescanningの下の設定を入力します。注: これらの設定は、ユーザーに表示し、最大 3 つのスライドを移動できるように作成されています。各スライドは、簡単なナビゲーションのための 3 の隣接する井戸に分割されているし、’ライブ’ 組織スライスまたは細胞の可視化。 [訪問サイト] タブでサイトに井戸を均一に埋めます。 プレート下部設定の編集…] をクリックし、図 1 bに表示される値を入力します。 集録ループ] タブで、[プレビュー スキャンの所望の波長 (この例では、核の染色) を入力します。最高のコントラストと画像ベースの焦点は、最も明るい蛍光信号 (例えば、しばしば核染色) を使用します。これにより、バック グラウンドと比較してコントラストの高いのでメモ: 核染色など明るい染みのついた組織を染色推奨します。サンプルの場所にこの援助をするだけ、明るい色を他の色のイメージのオフセットを基に使用されます次の高倍率獲得の 1 つ以上の蛍光イメージングしているとき、。 画像を一緒にステッチするプレート ・ アクイジション ・ モードでは、シェーディング補正を有効にします。 A. 設定としてこの設定を保存します。 3. 高倍率でスライド取得の設定の作成 プレート獲得のセットアップ] ダイアログ ボックスでに行く目的とカメラのタブ選択 40 X (最高デジタル解像度の)、ビニング カメラとして 1 と 2 (信号と画像の明るさを向上させる) を利得として、倍率として。注: は、対物レンズの倍率を低く設定を使用できますが、筆者は 40 X 人間ミクログリアと多波長セル スコアリングモジュールを使用して脳腫瘍組織におけるマクロファージの分析に最適の設定をします。 プレート-Slidescanningおよび編集プレート下部の設定… ] タブと同じ A の設定は、すべての設定を確認 (手順 2 を参照してください)。 得られる画像が鮮明ではなく、フォーカスを調整する井戸の深さ、プレートの高さ、およびプレートの下の設定を変更します。フォーカスの問題はまだ、オート フォーカス オプション] セクションの下でイメージの回復とレーザーを選択します。 集録ループ] タブで、[、サンプルで現在の波長の数を入力します。レーザー ベースの焦点を有効にして、イメージ ベースの (買収またはレーザー回復) の焦点を有効にするオプションを確認します。 [オート フォーカス] タブ [プレートと下部にもフォーカスを選択します。 仕訳帳] タブで、図 2も選択できないようにする非同期ハードウェアに移動を確実に記載されているオプションを選択します。 B. 設定としてこの設定を保存します。 4. 広視野高コンテンツ分析システムでスライドを配置します。 メイン メニューを表示f4 キーを押します。スライドのスキャンを選択します。オープンドア-取り出しスライドをクリックし、(図 3 a と 3 b) WHCAS スライドとスライド アダプター (が最大 3 つのスライドを保持できる) に挿入します。下向き coverslip スライド アダプター (図 3 a) の切り込み側にラベルとスライドを向き。注: この実験で使用するスライドは、1 mm スライド x 75 x 標準 25 でした。 ドアを閉じる-スライドをロードするをクリックします。 5. プレビュー スキャンを取得 スクリーニングの見出しの下プレート集録/制御.とプレートの取得設定を選択し、設定 A に読み込む 訪問する井戸タブの下も含むサンプルでは、マウスの右ボタンを使用して移動します。訪問するサイトタブの下には、セルがあるまでライブ画像キャプチャと別のサイトに移動します。手動でサンプルに焦点を当てるか、オート フォーカスを使用します。スナップを使用して、イメージをキャプチャします。注: このサンプルは、詳細サイトやフィッティングもサイトで検索が容易に (手順 2.3 を参照してください)。 メイン メニューのスライドのプレビューを選択します。 自動的にポップアップ表示されるダイアログ ボックスでスキャンしようとしているどのように多くのスライドを反映してオプションを選択します。一度に 1 つのスライドをスキャンします。[Ok]を押します。倍率として 4 X を選択します。[Ok]を押します。スライドの向きを (使用する補正カラー別 coverslip の厚さが使用される場合) としてCoverslip (0.17 mm) ダウンを選択します。[Ok]を押します。続行をクリックします。注: ユーザーが 2 以上のスライドのプレビュー スキャンを取得しようとすると、各プレビュー スキャンは、個別に対応する高倍率の画像の獲得の前に開きます。 [ロード スキャン スライド設定]取得の設定、キャリブレーションのボックスがチェックされますを確認します。ボタンを押してキャンセルします。スライド設定のスキャンボックスが再び表示される場合は、続行を選択します。 スライドをスキャン] ダイアログ ボックスが表示されたら、図 4 a-4 Cで推奨されている設定を調整します。閉じる終了を選択します。注: は、低いデジタル解像度、ダイナミック レンジ、それぞれ、それ故に減少の画質とはいえ高速スキャンになりますカメラのビニングとカメラの露光時間の減少を増加します。シェーディング補正は単一の視野間一様な強度を保ちます。スキャンは、フォーカス、走査速度が低下、ハードウェアとイメージのオート フォーカス オンされますを確認します。時間を節約、低倍率のスキャンを取得しながら陰影補正とハードウェアとオフ画像のオート フォーカスを持っているが、これらのオプションを持っているオン手順 6 の高倍率画像の中にそれをお勧めします。低倍率のスキャンの解像度は、高倍率のスキャンの解像度には影響を与えません。 スライドのスキャニング データ用のディレクトリを選択します。[Ok]をクリックします。ファイルの名前を入力します。[Ok]をクリックします。 描画領域] ダイアログ ボックスが自動的に表示されます。図 5 bに示すように、全体のプレビューのスキャン領域を選択するには、矩形ツール (図 5 a) を使用します。続行をクリックします。 [セットアップの完了] ダイアログ ボックスが表示されます。続行を選択します。注: プレビュー スライドのスキャンを開始します。 プレビューを完了すると、スキャン完了のダイアログ ボックスが表示されます。続行を選択します。プレビュー スキャン ウィンドウは閉じないで (この例では、 DAPI スキャンウィンドウは図 6を参照)。注: セットアップと低倍率スキャン習得過程約 20 分になります。後続の高倍率画像の取込時間は各チャンネルの露出度だけでなく、選択したサイトの数によって異なります。 6. 高倍率のスキャン B. の設定をロードします。 イメージを作成する井戸を決定します。訪問する井戸タブの下も含むサンプルでは、マウスの右ボタンを使用して移動します。注:、技術がよく 1 をイメージングによって実証ここ。 訪問するサイトのタブの下には、細胞や組織があるまでLiveの機能を持つ別のサイトに移動します。手動でサンプルに焦点を当てるか、オート フォーカスを使用します。スナップを使用して、イメージをキャプチャします。注: 高倍率でサンプルを見つけるを支援するためには、どこでも 5 からオート フォーカスできない場合は、サンプルを見つけるの 100 μ m のステップ サイズ調整するのにプレート集録/制御ダイアログを使用します。 W1 DAPI ] タブで、[自動公開をクリックします。鮮明なプレート取得スナップ – DAPIイメージを確認します。 メイン メニューで、[ジャーナルプルダウン ・ メニューを明らかにするためにクリックします。ジャーナル. を実行を選択します。 それを起動してスライド領域取得セットアップジャーナルをダブルクリックします。セットアップのスライド領域の取得] ダイアログ ボックスが表示されたら、続行を選択します。 指示されると、正しく、 DAPI スキャン低倍率スライド イメージを選択するを選択します。[Ok]を押します。同様に、強調表示プレート取得スナップ – DAPI プレート取得スナップを求められたとき。[Ok]をクリックします。 作成またはロード領域ボックスが表示されたら、DAPI スキャン (図 6) 利息の (a) の地域を選択するのに四角形領域ツールを使用します。続行を押します。注: 40 X で選択できる最大面積は、45 列、35 行です。興味の複数の領域を選択すると、最大領域] ボックスに領域のサイズが変更されます。サイズ変更後は、ボックスの位置を変更できます。 負荷領域] ダイアログ ボックスでいいえを選択します。注: 選択はい負荷以前に保存したスライドのバッチのための領域の興味の場所の同じ地域。 検索ツールを使用すると、関心の最大領域をハイライトし、 [領域の選択] ダイアログ ボックスで続行を押します。領域の確認ボックスが表示されたら、続行を選択します。保存領域] ダイアログ ボックスが表示されたら保存する領域が必要かどうかを決定します。 サイトの間隔、次のダイアログ ボックスでは、タイル重複、または10% の重複なしでイメージで結果を選択することができます。オプションを選択し、 [ok]をクリックします。著者は、タイルを選んだ。 3 つのダイアログ ボックスが今すぐ表示されます。セットアップの完了ボックスは、続行を押すことで閉じることができます。40 X の取得サイトのセットアップボックス (図 7 a) を開いたまま今のところ明確などのように多くの列になりますので行プレート取得セットアップボックス (図 7 b) に入力する必要があります。WellPositionsボックス (図 7) が表示されたら左下隅で開いたまま、イメージングの持続期間のため。 訪問する井戸、下のプレート取得セットアップボックスで以前に選択した関心領域と同数の井戸がある必要があります (図 7) を強調表示します。注: スライドあたりの金利の 9 つの地域の最大のこのプロトコルを開発しました。場合はより多くがある、関心領域の数を反映するプレート – SlideScanningタブに列または行の数を増やします。これらの井戸が空間的任意の方法で関心領域の場所を表さないが、適切な数は、強調表示されている (左クリック) をする必要があります。 プレート取得設定ボックスで訪問するサイト] タブに移動は、提示された列と行 (図 7 b) を入力します。タイルのサイト上をクリックしてください。 サンプルが含まれているサイトを見つけることの当て推量を排除するために事前に選択した関心領域にステージを配置する[概要] タブの下でプレートの取得を押します。カメラをパン細胞を含むサイトを一度、画像の取得を停止するには、右下隅でキャンセルを押します。舞台は現在を確認、サンプル上に位置します。 重点的と高ダイナミック レンジ画像が得られることを確保するための波長設定を最適化します。問題がなければ、[概要] タブとプレートの取得をクリックします。 7. 画像解析 目的のカスタム モジュールを選択します。注: 著者は、脳腫瘍のスライドの自動セグメンテーションを実証する多波長セル スコアリングモジュールを選んだ。 すべてのサイトの分析を実行します。解析パラメーターは、多くのスライドのため同じです、プレート取得セットアップボックス [投稿買収] タブで分析が囲めます。 分析が完了すると、結果をバイアスしないように画質の悪さのすべてのサイトを除外します。この分析の目的は小グリア細胞および腫瘍細胞のマクロファージを定量化するため、腫瘍サンプルのエッジに関心の領域を選択します。さらに、焦点がずれているおよび/または組織のひだまたは泡およびティッシュで涙を含むサイトを除外します。デモンストレーションでは、代表の結果を参照してください。また、どのサイトが除外される以下のしきい値としてレーザー反射の振幅によってサイトごとに生成されるレーザー フォーカス スコアを使用して (しきい値は、カスタマイズと露光時間などのパラメーターによって異なります、使用するメディアの種類)。メモ: 高倍率画像ください必要に応じて具体的には大きな血管や壊死の領域などの構造を除外すること。また、hypercellular などの関心のある分野だけを含めることが可能です。このように、特異性、分析の精度を向上できます。