Автоматизированных слайд сканирование и сегментации в дневно меченых тканей, с использованием системы анализа Widefield высоким содержанием
Summary
Здесь мы описываем протокол для автоматической сегментации дневно обозначенные тканей на слайдах с помощью системы анализа высоким содержанием widefield (WHCAS). Этот протокол имеет широкие применения в любой области, которая включает в себя количественный флуоресцентных маркеров в биологических тканях, включая биологических наук, медицинской техники и медицинских наук.
Abstract
Автоматизированное сканирование слайдов и сегментация дневно меченых тканей является наиболее эффективным способом для анализа всей слайды или разделов больших ткани. К сожалению многие исследователи проводят большое количество времени и ресурсов, разработке и оптимизации рабочих процессов, которые актуальны только для их собственных экспериментов. В этой статье мы опишем протокол, который может использоваться теми, с доступом к системе анализа высоким содержанием widefield (WHCAS) для изображений слайд установлен ткани, с параметрами для настройки внутри встроенных модулей в соответствующее программное обеспечение. Первоначально не предназначались для сканирования слайдов, шаги подробно в этой статье позволяют приобрести слайд, сканирование изображений в WHCAS, который может быть импортирован в соответствующее программное обеспечение. В этом примере продемонстрировал автоматизированные сегментации слайды опухоли мозга, но возможен автоматизированный сегментации любой дневно меченых ядерные и цитоплазматические маркер. Кроме того существует целый ряд других количественных программных модулей, включая анализы для локализации/транслокации белка, сотовой распространения/жизнеспособности/апоптоз и ангиогенез, которая может быть запущена. Этот метод будет сэкономить время исследователи и усилия и создать автоматизированные протокол для анализа слайд.
Introduction
Точное и точный количественный дневно меченых тканей на слайдах высоко востребованных методика во многих научных областях. Однако исследователи часто вручную количество образцов или потратить значительное количество времени на разработку эзотерических автоматизированных методов для достижения этой цели. Здесь мы предоставляем протокол для автоматизированных слайд сканирование и количественный клеток с использованием WHCAS и его соответствующее программное обеспечение, с innate иммунных клеток в замороженных человеческого мозга опухоль секций в качестве примера. Соответствующее программное обеспечение предлагает широкий спектр встроенных настраиваемых модулей от neurite нарост подсчета для дифференцировки клеток типы1,2,3,4,5, 6. Цель данного метода является предоставить исследователям старт финиш, легко воспроизводимые протокол для получения изображения и quantitate дневно меченых образований в тканях любой слайд установлен.
В этом протоколе WHCAS в основном используется для визуализации пластины для последующего анализа на соответствующее программное обеспечение, несмотря на то, что слайд-адаптер и основам скользить сканирования7 были доступны. Это было непомерно изображения слайдов, потому что тщательного пространственных калибровки области приобретения, выбор соответствующих журналах, создание специализированных loadouts и связь с представителями продукта необходимы. В организме более широкого литературы, вместо покупки выделенный слайд томографии и анализа аппарат8предыдущих технологических отчет с доступом к это программное обеспечение обойти захвата изображений слайдов на WHCAS altogether9. Анализ изображений приобретения или изображения на различных платформах требует дополнительную работу, чтобы убедиться, что каждый совместим с другой.
Возможность использования WHCAS и его программное обеспечение для захвата изображений позволит избежать ненужных осложнений поиска или разработки рабочего процесса, чужды эти инструменты. В этой статье, шаги, необходимые для создания малое увеличение обзор сканирования и соответствующие высоким увеличением изображения, рассматривая слайд как плита, и последующего анализа с использованием модуль сегментация мульти волны клеток скоринга позволяют повторное использование из WHCAS. Это легко использовать протокол предоставляет преимущество над альтернативные методы потому, что нет необходимости разрабатывать алгоритмы или многоэтапный подсчета протоколы10,11 после изображения приобретаются на WHCAS. Этот протокол уменьшает время, необходимое для оптимизации количественный метод, является более точным12 и эффективным, чем ручной подсчет и максимизирует использование WHCAS. Этот протокол может легко и широко использоваться поскольку он дает возможность обработки изображений и анализа любых дневно меченых тканей на слайдах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Общие проблемы еще, препятствующих эффективности исследований в области биологических наук является разработка протоколов для объективной, точной и точные количественной дневно меченых тканей и их структур. Значительное количество времени и усилий направлена на поиск путей для анализа тканей слайды после того, как они были образы. Многие существующие методы предоставляют алгоритмы для пользователей, чтобы воссоздать в рамках программы12,,1314. Эти методы являются приемлемыми, но значение этого доклада является, что она позволяет пользователю легко и быстро создать целостный образ приобретение и Протокол анализа, если пользователь имеет доступ к WHCAS. Анализов, которые дифференцировать типы клеток и количественно несколько структур и процессов, анализ клеточного цикла и ядерной транслокации, к примеру, уже доступны в соответствующее программное обеспечение.
Установка включает в себя несколько важных шагов. Во-первых пространственные параметры слайда определены как будто это блюдо. Во-вторых малое увеличение обзор сканирования будет создан, из которой отбираются областей, представляющих интерес для большого увеличения изображений. И наконец сайты, которые влияют на точность и повторяемость последующих анализов исключаются. Крупнейших ограничением этой методики является, что его применимости зависит от, если пользователь имеет доступ к WHCAS. Однако, растущая потребность для высоких контент-анализа систем, многие учреждения предоставляют эти их исследователям, чтобы оставаться конкурентоспособным15. Устранение неполадок необходимо чаще всего когда разделов ткани не имеют той же толщины. Если выбраны несколько областей, представляющих интерес, некоторые будут в центре внимания, в то время как другие не будут. В идеале при резании, пользователь будет заботиться для создания однородной образцы. Однако если образцы являются несовместимыми, акцент на ядерной пятно волны (или ярких Флюорофор пользователя), который используется для фокус, может быть подрегулировано для каждого из из фокус региона интерес и даже для каждого поля зрения. Как другие длины волн просто смещение от ядерной пятно волны, только этой волны требует переналадки.
В настоящем докладе мы подробно, как проверять и анализировать слайды с помощью WHCAS и соответствующее программное обеспечение. Мульти волны клеток скоринга модуль позволяет пользователю автоматически рассчитывать любой ядерной или цитоплазматических маркеров, которые помечены дневно. После настройки фокуса и определение сотовой характеристиками, как ширина и области для настройки модуля в ткани образы, нет никаких дальнейших необходимость вмешательства пользователя для получения образа слайды и количественных данных. До трех слайдов может отражаться в то время, и могут быть определены несколько областей, представляющих интерес. Этот протокол позволяет WHCAS пользователей, которым необходимо анализировать слайды воспользоваться настраиваемым, многоцелевые, автоматизированные рабочие процессы, которые требуют немного не оптимизации и может применяться в любых проектов в будущем, которые включают гистологический анализ ткани.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался грант от канадской институтов медицинских исследований и Альберта новшество – решения/Альберта рак Фонда здравоохранения. Авторы хотели бы отметить блок регенерации в нейробиологии основной объект для использования их оборудования, работа Paula Gedraitis в здании фундамент, на котором слайд сканирование на WHCAS стало возможным и создатель продукции упомянутые в этой статье, молекулярных устройств.
Materials
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer’s disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
