Summary

El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

Published: April 24, 2018
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Summary

El epicardio desempeña un papel crucial en el desarrollo y la reparación del corazón células y factores de crecimiento para la pared miocardio. Aquí, describimos un método para las células epicárdicas primaria humanas cultura que permite el estudio y comparación de sus características de desarrollo y adultos.

Abstract

El epicardio, un capa de células epiteliales que cubre el miocardio, tiene un papel fundamental durante el desarrollo cardíaco, así como en la respuesta de reparación del corazón después de lesión isquémica. Cuando se activa, las células epicárdicas se someten a un proceso conocido como epitelial de transición mesenquimal (EMT) para proporcionar a las células para regenerar miocardio. Además, el epicardio contribuye mediante la secreción de factores paracrinos esencial. Para apreciar el potencial regenerativo del epicardio, se requiere un modelo de célula humana. Aquí esbozamos un modelo de cultura de célula novela para derivar las células derivadas epicárdicas primarias (EPDCs) del tejido cardiaco adulto y fetal humano. Para aislar EPDCs, el epicardio es disecado desde el exterior de la pieza de corazón y transformar en una suspensión unicelular. A continuación, EPDCs son plateados y cultivadas en medio de la CDEP que contiene el inhibidor de la 5-quinasa ALK SB431542 mantener su fenotipo epitelial. EMT es inducida por la estimulación con TGFβ. Este método permite, por primera vez, el estudio del proceso de EMT epicárdico humano en un ambiente controlado y facilita el obtener una visión más clara en el secretoma de EPDCs que puede ayudar a la regeneración del corazón. Además, este enfoque uniforme permite la comparación directa de la conducta humana adulta y fetal epicárdico.

Introduction

El epicardio, un capa epitelial unicelular que sobres el corazón, es de vital importancia para el desarrollo cardíaco y reparación (revisado en Smits et al. 1). retraso mental, el epicardio deriva el órgano proepicárdicas, una pequeña estructura situada en la base del corazón en desarrollo. Desarrollo día E9.5 en Concepción después de 4 semanas en ser humano y el ratón, las células comienzan a migrar desde esta estructura de coliflor y cubrir el desarrollo del miocardio2. Una vez que se forma una capa única de células epiteliales, una porción de las células epicárdicas sufre epitelial de transición mesenquimal (EMT). Durante la EMT, las células pierden sus características epiteliales, tales como adhesiones célula-célula y obtención un fenotipo mesenquimal que les da la capacidad de migrar en el miocardio en vías de desarrollo. Las células derivadas epicárdicas formadas (EPDCs) pueden distinguir en varios tipos de células cardiacas incluyendo fibroblastos, células musculares lisas y potencialmente cardiomiocitos y células endoteliales3, aunque la diferenciación de estos últimos dos celulares las poblaciones sigue siendo objeto de debate (revisado en Smits et al. 4). Además, el epicardio proporciona señales instructivas paracrina al miocardio para regular su crecimiento y vascularización5,6,7,8. Múltiples estudios han demostrado que formación epicárdica deteriorada conduce a defectos de desarrollo en músculo cardiaco9,10, vasculatura11y conducción sistema12, haciendo hincapié en lo esencial contribución de epicardio a la formación del corazón.

Aunque el epicardio está presente como una capa inactiva en el corazón adulto, se llega a ser reactivado a isquemia13. Después de la lesión epicárdica reactivación recapitulan varios de los procesos describen para el desarrollo cardíaco, incluyendo proliferación y14de la EMT, aunque menos eficientemente. Curiosamente, aunque el mecanismo exacto no se entiende completamente, la contribución epicárdica a reparar se puede mejorar mediante tratamiento con, por ejemplo, timosina β415 o modificado ARNm del VEGF-A16, dando por resultado cardiaco mejoró función después de infarto de miocardio. El epicardio, por tanto, se considera una fuente interesante de celular para mejorar la reparación endógena del corazón lesionado.

Mecanismos del desarrollo cardíaco a menudo son recapitulados durante la lesión, aunque de manera menos eficiente. En busca de activadores epicárdicos, es de suma importancia que podemos determinar y comparar la capacidad total de epicardio fetal y adulto. Por otra parte, desde un punto de vista terapéutico, es importante que, además de los experimentos con animales, ampliamos conocimientos sobre la respuesta del epicardio humana. Aquí, describimos un método para aislar y adulto y fetales epicárdicas derivado las células humanas (EPDCs) en una morfología epitelial-célula-como de la cultura y para inducir la EMT. Con este modelo, nuestro objetivo es explorar y comparar el comportamiento adulto y fetal la célula epicárdico.

La principal ventaja de este protocolo es el uso de material epicárdico humano, que no ha sido bien estudiado. Lo importante, el protocolo de cultivo aislamiento y celular descrito proporciona un método uniforme para derivar ambos EPDCs adoquín fetal y adulto, lo que permite una comparación directa entre estas fuentes de dos células. Además, desde el epicardio está aislado basado en su ubicación, se asegura que las células son realmente epicardially derivada17.

Mientras que previamente se han establecido métodos de aislamiento de DAPC humanos, estos en su mayoría dependen de protocolos de derivación donde se platean pedazos de tejido cardiaco o epicárdico en una célula cultura plato18,19. Este enfoque lo selecciona específicamente por células que pierden parcialmente su fenotipo epitelial para migrar, y que son más propensos a experimentar la EMT espontánea. En el protocolo actual, el epicardio se transforma primero en una solución única célula que permite el EPDCs aislados mantener su estado epitelial. Este método por lo tanto proporciona un modelo sólido en vitro para estudiar la EMT epicárdico.

Protocol

Todos los experimentos con muestras de tejido humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Leiden University Medical Center y se ajusta a la declaración de Helsinki. Todas las medidas se realizan con equipo estéril en un flujo de la cultura de célula gabinete. 1. preparaciones Preparar medio de DAPC mezcla de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM low-glucosa) y medio 199 (M199) en una proporción 1:1. Agregar 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS, calor …

Representative Results

Aquí, describimos un protocolo sencillo para aislar EPDCs de tejido humano adulto y fetal cardiaco (figura 1). Este protocolo aprovecha la ubicación fácilmente accesible del epicardio en la parte exterior del corazón (figura 1A). La coloración de la aurícula del corazón después de disección demuestra que el WT1 + epicardio se retira mientras que la subyacente subepicárdico matriz extracelular y tejido miocárdico perman…

Discussion

Aquí describimos un protocolo detallado para aislar y la cultura primarias epicárdicas células derivadas de los corazones humanos adultos y fetales. Amplia caracterización de estas células ha sido previamente publicado17. Hemos demostrado que se pueden mantener ambos tipos de células como las células epiteliales de adoquines-como cuando se cultivan con el inhibidor de la cinasa del ALK5 SB431542. EMT es una parte integral de activación epicárdica en vivo durante el desarrollo y l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación es apoyada por la organización de países bajos para la investigación científica (NWO) (VENI 016.146.079) y una beca de investigación LUMC a AMS y Stichting LUMC de Bontius (MJG).

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

References

  1. Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
  2. Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
  3. Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
  4. Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
  5. Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
  6. Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
  7. Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
  8. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
  9. Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
  10. Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
  11. Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
  12. Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
  13. van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
  14. Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
  15. Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
  16. Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
  17. Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
  18. Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
  19. Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
  20. Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
  21. Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).

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Cite This Article
Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

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