Summary

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

Published: April 24, 2018
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Summary

Die Epicardium spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reparatur des Herzens durch die Bereitstellung von Zellen und Wachstumsfaktoren der myokardialen Wand. Hier beschreiben wir eine Methode, um menschliche primäre epicardial Zellkulturen, die die Studie und den Vergleich ihrer Entwicklungs- und Erwachsenen Eigenschaften ermöglicht.

Abstract

Epicardium, eine epitheliale Zellschicht auf das Myokard hat eine wesentliche Rolle während der kardialen Entwicklung, sowie die Reparatur als Reaktion des Herzens nach ischämischen Verletzung. Wenn aktiviert, durchlaufen epicardial Zellen ein Verfahren bekannt als epitheliale Mesenchymale Transition (EMT) Zellen zu regenerierenden Myokard zu bieten. Darüber hinaus trägt die Epicardium durch Sekretion von wesentlichen Parakrine Faktoren. Um das regenerative Potential der Epicardium vollständig zu verstehen, ist eine menschliche zellenmodell erforderlich. Hier beschreiben wir eine neuartige Zellmodell der Kultur um menschliche Erwachsene und fetalen Herzgewebe primäre epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) abgeleitet. Um EPDCs zu isolieren, ist die Epicardium von außen auf das Herz-Exemplar seziert und zu einem einzigen Zellsuspension verarbeitet. Als nächstes sind EPDCs überzogen und in EPDC die ALK-5-Kinase-Inhibitor SB431542 weiterhin ihre epithelialen Phänotyps-haltigem Medium kultiviert. EMT wird durch Stimulation mit TGFβ induziert. Diese Methode ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung des Prozesses der menschlichen epicardial EMT in einer kontrollierten Umgebung und ermöglicht mehr Einblick in die Secretome des EPDCs, das Herz Regeneration helfen kann. Darüber hinaus ermöglicht dieser einheitlichen Ansatz zum direkten Vergleich der menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial Verhalten.

Introduction

Die Epicardium, eine einzellige Epithelschicht, dass Umschläge das Herz ist von entscheidender Bedeutung für die kardiale Entwicklung und Reparatur (rezensiert in Smits Et al. 1). Entwicklungsgeschichtlich, die Epicardium ergibt sich aus der Proepicardial-Orgel, eine kleine Struktur, die am Fuße des Herzens entwickeln. Um Entwicklungsstörungen Tag E9.5 Maus und 4 Wochen Post-Konzeption in der Human-beginnen Zellen migrieren aus dieser Blumenkohl-Struktur und decken die entwickelnden Myokard-2. Sobald ein einzelnes epitheliale Zellschicht gebildet wird, wird ein Teil der epicardial Zellen epithelialen, Mesenchymale Transition (EMT) unterzogen. Während EMT Zellen verlieren ihre epithelialen Eigenschaften wie Zell-Zell-Verwachsungen, und erhalten einen mesenchymalen Phänotyp verleiht ihnen die Fähigkeit, in den Entwicklungsländern Myokard einwandern. Die gebildeten epicardial abgeleiteten Zellen (EPDCs) können in mehrere kardiale Zelltypen, einschließlich der Fibroblasten, glatten Muskelzellen und potenziell Kardiomyozyten und Endothelzellen3, unterscheiden, obwohl Zell-Differenzierung des letzteren zwei Populationen bleibt Gegenstand der Debatte (rezensiert in Smits Et al. ( 4). Darüber hinaus bietet die Epicardium lehrreich Parakrine Signale an den Herzmuskel, deren Wachstum und Vaskularisierung5,6,7,8zu regulieren. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Sehbehinderte epicardial Bildung zu Entwicklungsschäden im Herzmuskel9,10, Gefäßsystem11und Wärmeleitung System12 führt, betont das wesentliche Beitrag von Epicardium zur Bildung des Herzens.

Obwohl Erwachsene inmitten der Epicardium als ruhende Schicht vorhanden ist, wird es bei der Ischämie13reaktiviert. Epicardial Reaktivierung nach der Verletzung mehrere rekapituliert die Prozesse beschrieben für kardiale Entwicklung, einschließlich Verbreitung und EMT14, wenn auch weniger effizient. Interessant ist, obwohl der genaue Mechanismus ist nicht vollständig geklärt, die epicardial Beitrag zur Reparatur kann durch Behandlung mit z. B.Thymosin β415 verbessert werden oder geändert VEGF-A mRNA16, wodurch verbesserte Herz-Kreislauf Funktion nach Myokardinfarkt. Die Epicardium gilt daher eine interessante Zelle Quelle, endogene Reparatur des Geschädigten Herzens zu verbessern.

Mechanismen der kardialen Entwicklung sind oft bei Verletzungen, obwohl auf eine weniger effiziente Weise zusammengefaßt. Auf der Suche nach epicardial Aktivatoren ist es sehr wichtig, dass wir bestimmen und die volle Kapazität des fetalen und adulten Epicardium vergleichen. Aus therapeutischer Sicht ist es darüber hinaus wichtig, dass neben der Tierversuche, wir wissen in Bezug auf die Reaktion des menschlichen Epicardium erweitern. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) in einer epithelialen Zellen ähnliche Morphologie und EMT zu induzieren. Mit diesem Modell wollen wir entdecken und vergleichen Sie Erwachsene und fetalen epicardial Zelle Verhalten.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von epicardial Menschenmaterial, die nicht gründlich untersucht worden. Wichtig ist, sieht das beschriebene Isolation und Zelle Kultur-Protokoll eine einzige einheitliche Methode um beide fetalen und adulten Kopfsteinpflaster EPDCs, so dass einen direkten Vergleich zwischen diesen beiden Quellen abzuleiten. Zusätzlich, da die Epicardium isoliert aufgrund seiner Lage ist, ist sichergestellt, dass die Zellen tatsächlich epicardially abgeleiteten17.

Während menschliche EPDC Isolierung Methoden bereits aufgebaut haben, setzen diese meist auf Auswuchs Protokolle wo Stücke von Herz- oder epicardial Gewebe auf eine Zelle Kultur Teller18,19überzogen sind. Dieser Ansatz wählt dabei speziell für Zellen, die teilweise ihre epithelialen Phänotyps verlieren, um zu migrieren, und sind anfälliger für spontane EMT unterziehen. In das aktuelle Protokoll erfolgt die Epicardium zuerst in eine einzelne Zelle Lösung erlaubt die isolierte EPDCs um ihre epitheliale Status beizubehalten. Diese Methode stellt daher eine solide in-Vitro -Modell, um epicardial EMT zu studieren.

Protocol

Alle Experimente mit menschlichen Gewebeproben wurden von der Ethikkommission des Leiden University Medical Center genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki. Alle Schritte werden mit steriler Ausrüstung in einer Zelle Kultur Strömung Schrank ausgeführt. 1. Vorbereitungen Bereiten Sie EPDC Medium durch Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM Low-Glucose) und Medium 199 (M199) im Verhältnis 1:1 mischen. Fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fötalen Rinderserum (FB…

Representative Results

Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll zur EPDCs von menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzgewebe (Abbildung 1) zu isolieren. Dieses Protokoll nutzt die verkehrsgünstige Lage der Epicardium an der Außenseite des Herzens (Abbildung 1A). Färbung des Herzens Ohrmuschel nach Dissektion zeigt, dass die WT1 + Epicardium entfernt wird, während die zugrunde liegenden Subepicardial extrazelluläre Matrix und Herzmuskelgewebe …

Discussion

Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll zu isolieren und Kultur primäre epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzen abgeleitet. Umfassende Charakterisierung dieser Zellen wurde bisher veröffentlichten17. Wir haben gezeigt, dass beide Zelltypen als Epithelzellen Kopfsteinpflaster-wie, wenn mit dem ALK5-Kinase-Inhibitor SB431542 kultiviert aufrechterhalten werden können. EMT ist fester Bestandteil des epicardial Aktivierung in Vivo während der Entwicklung…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wird durch die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (VENI 016.146.079) und ein LUMC Forschungsstipendium für AMS und LUMC Bontius Stichting (MJG) unterstützt.

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

References

  1. Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
  2. Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
  3. Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
  4. Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
  5. Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
  6. Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
  7. Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
  8. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
  9. Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
  10. Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
  11. Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
  12. Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
  13. van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
  14. Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
  15. Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
  16. Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
  17. Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
  18. Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
  19. Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
  20. Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
  21. Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).

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Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

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