הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות
Summary
Epicardium ממלאת תפקיד מכריע ההתפתחות והתיקון של הלב על ידי מתן תאים גורמי גדילה לדופן שריר הלב. כאן, אנו מתארים שיטה לתאי epicardial ראשי האדם תרבות המאפשרת את המחקר והשוואה בין המאפיינים שלהם למבוגרים ובעיות התפתחותיות.
Abstract
Epicardium, שכבת תאים אפיתל כיסוי שריר הלב, יש תפקיד חיוני במהלך התפתחות הלב, כמו גם התגובה תיקון הלב לאחר פציעה איסכמי. כאשר מופעלת, תאים epicardial עוברים תהליך המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) כדי לספק לתאי שריר הלב ההתחדשות. יתר על כן, epicardium תורמת באמצעות הפרשת גורמים חיוניים paracrine. כדי להעריך את פוטנציאל הרגנרציה של epicardium, דרושה דוגמנית התא האנושי. כאן אנחנו חלוקה לרמות מודל תרבות תא הרומן לנבוע ראשי תאים נגזר epicardial (EPDCs) ברקמת הלב האנושי למבוגרים ו עוברית. כדי לבודד EPDCs, epicardium גזור מבחוץ של הדגימה הלב, מעובד להשעיה תא בודד. בשלב הבא, EPDCs מצופה, תרבותי EPDC בינוני המכיל את המדכא 5-קינאז ALK SB431542 לשמור על פנוטיפ אפיתל שלהם. החובשים הנגרמת על ידי גירוי עם TGFβ. שיטה זו מאפשרת, לראשונה, חקר התהליך של החובשים epicardial אנושית בסביבה מבוקרת, ומקל צובר יותר על בסיס secretome של EPDCs עשוי לסייע הלב התחדשות. יתר על כן, גישה אחידה זו מאפשרת השוואה ישירה ההתנהגות האנושית למבוגרים ו עוברית epicardial.
Introduction
Epicardium, שכבת האפיתל תא בודד מעטפות הלב, הוא בעל חשיבות פיתוח הלב ותיקון (נבדקה בסמיתס. ואח 1). נכה, epicardium נובע העוגב proepicardial, מבנה קטן הממוקם בבסיס הלב המתפתח. סביב יום התפתחותית E9.5 העכבר ולאחר 4 שבועות תפיסה פוסט-אנוש, התאים להתחיל להעביר מתוך מבנה כרובית ולכסות את שריר הלב המתפתח2. ברגע נוצרת שכבה תא אפיתל בודד, חלק מהתאים epicardial עובר אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים). במהלך אמבולנס, תאים לאבד את מאפייני האפיתל שלהם, כגון תאים תאים הדבקויות, ולקבל הפנוטיפ mesenchymal אשר נותן להם את היכולת להעביר לתוך שריר הלב המתפתח. התאים נגזר epicardial בנוי (EPDCs) יכולים להתמיין מספר סוגי תאים הלב כולל fibroblasts, תאי שריר חלק, ואת פוטנציאל cardiomyocytes תאי אנדותל3, למרות בידול של האחרונים שני תא האוכלוסיות נותר כפוף הדיון (נבדקה בסמיתס. et al. 4). יתרה מכך, epicardium מספק אותות paracrine מאלף אל שריר הלב כדי לווסת את הצמיחה ואת vascularization5,6,7,8. מחקרים רבים הוכיחו כי היווצרות epicardial לקוי מוביל ליקויים התפתחותיים-שריר הלב9,10, להערכת11, הולכה מערכת12, תוך שימת דגש ארומטיים התרומה של epicardium את היווצרות של הלב.
למרות בלב למבוגרים epicardium קיים כשכבה רדום, זה הופך להפעיל על איסכמיה13. Epicardial הפעלה מחדש לאחר פציעה recapitulates מספר התהליכים המתוארים לפיתוח לב, כולל הפצת החובשים14, אם כי פחות ביעילות. מעניין, למרות המנגנון המדויק אינה מובנת במלואה, התרומה epicardial לתקן ניתן לשפר על ידי טיפול עם, למשל, β4? ואת מוכנה15 או שונו VEGF-A mRNA16, וכתוצאה מכך יושבחו דום לב פונקציה לאחר אוטם שריר הלב. Epicardium ולכן היא נחשבת מקור תא מעניינים לשיפור ותיקון אנדוגני של הלב הפצוע.
מנגנוני התפתחות הלב הם לעתים קרובות recapitulated במהלך פציעה, אם כי באופן פחות יעיל. בחיפוש אחר מפעילים epicardial, זה בעל חשיבות עליונה. כי אנחנו יכולים לקבוע ולהשוות לקיבולת המלאה של epicardium העובר ואת למבוגרים. יתר על כן, מנקודת מבט טיפולית, זה חשוב, בנוסף לניסויים בבעלי חיים, אנו להרחיב ידע לגבי התגובה של epicardium האנושית. כאן, אנו מתארים שיטה לבודד, תרבות למבוגרים ו עוברית epicardial נגזר תאים אנושיים (EPDCs) במורפולוגיה אפיתל תאים דמויי, כדי לעודד את החובשים. במודל זה, אנו שואפים לחקור ולהשוות בהתנהגות התא epicardial למבוגרים ו עוברית.
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש של חומר epicardial האנושי, אשר לא נחקרה ביסודיות. חשוב, פרוטוקול תרבות המתואר, בידוד ותא מספק שיטה אחידה אחת להפיק שני EPDCs חלוק עוברית, למבוגרים, המאפשרים השוואה ישירה בין מקורות שני תאים אלה. בנוסף, מאז epicardium הוא מבודד בהתבסס על המיקום שלו, זה מובטחת כי התאים נמצאים למעשה נגזרת epicardially17.
בעוד האדם שיטות בידוד EPDC הוקמו בעבר, אלה בעיקר להסתמך על פרוטוקולים תוצר איפה פיסות רקמת לב או epicardial הם מצופה על18,19מאכל התרבות התא. גישה זו בוחר ובכך במיוחד עבור תאים זה חלקית לאבד פנוטיפ אפיתל שלהם על מנת להעביר, ו זה נוטים יותר עוברים החובשים ספונטנית. בפרוטוקול הנוכחי, epicardium שהוא מעובד תחילה פתרון תא בודד אשר מאפשר את EPDCs מבודד לשמור על מצב אפיתל שלהם. שיטה זו מספקת ולכן מודל מוצק במבחנה ללמוד החובשים epicardial.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר של פרוטוקול מפורט כדי לבודד והתרבות תאים epicardial הראשית נגזר לבבות אדם מבוגר ו עוברית. אפיון מקיף של תאים אלה כבר שפורסמו בעבר17. אנחנו הראו כי שני סוגי תאים יכול להישמר כתאי אפיתל ריצוף דמוי כאשר תרבותי עם החומר המדכא קינאז ALK5 SB431542. החובשים הוא חלק בלתי נפרד של הפעלת epicard…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הולנד הארגון עבור מדעי למחקר (בתחרות) (VENI 016.146.079), LUMC מחקר לאגודה גם AMS, וגם Stichting Bontius LUMC (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
