Желчь соли индуцированной биопленки в кишечных патогенов: методы для идентификации и количественной оценки
Summary
Этот протокол позволяет читателю анализа соли желчных индуцированной биопленки в кишечных патогенов, используя многосторонний подход для захвата динамический характер бактериальных биопленок путем оценки соблюдения, формирования матрицы внеклеточного полимерные вещества, и дисперсией.
Abstract
Биопленки является динамичной, многоступенчатый процесс, который происходит в бактерий в суровых условиях окружающей среды или время стресса. Для кишечных патогенов значительный стресс ответ индуцируется во время транзита желудочно-кишечного тракта и при воздействии желчи, нормальной составляющей человека пищеварение. Чтобы преодолеть бактерицидный эффект желчи, многие кишечных патогенов образуют биопленки, предположили, чтобы разрешить выживания, когда транзитом через кишечник. Здесь мы представляем методологии для определения биопленки через присоединение твердофазный анализов, а также внеклеточного полимерные вещества (EPS) матрица обнаружения и визуализации. Кроме того Оценка дисперсии биопленки представлена имитировать анализ событий, вызывая релиз бактерий во время процесса инфекции. Фиолетовый Кристалл пятнать используется для обнаружения адэрентных бактерий в assay соблюдение высокой пропускной способностью 96-луночных пластины. Оценка производства EPS определяется двумя анализов, а именно микроскопии пятнать EPS матрицы и полуколичественного анализа с Лектин привязки дневно конъюгированных полисахарид. Наконец дисперсия биопленки измеряется с помощью графов колонии и обшивки. Позитивные данные из нескольких анализов поддерживают характеристику биопленки и могут быть использованы для выявления желчные соли индуцированной биопленки в других бактериальных штаммов.
Introduction
Биопленки является важным бактериальных выживания, индуцированной в суровых условиях окружающей среды. Подверженности бактерицидные соединения как антибиотики или изменения в питательных или наличие кислорода вызывает напряженного состояния в бактерии, которые могут быть решены через биопленки. Биопленки характеризуется бактериальных привязанность к поверхности или других бактерий и сопровождается секрецию EPS матрицы, в основном состоят из полисахаридов1,2,3. Биопленки представляет собой динамичный процесс, в котором каскад событий достигает кульминации в формировании зрелой адэрентных бактериальных сообщества1,2,3. Бактерии производят адгезины для облегчения начала вложения при переходе принимает ген выражение профили для укрепления вложений во время созревания биопленки. Одновременно производство EPS происходит пальто бактериальное сообщество в матрице защитить клетки от первоначального стресса. Бактерии, содержащиеся в биопленки растут медленно; и таким образом, сводит на нет большинство антибиотиков. Кроме того медленные темпы роста экономит энергию, пока изменения условий в пользу бактерий в1,2,3. После того, как прошло суровые условия, бактерии разогнать биопленки и возобновить планктона жизни1,2,3. Традиционно биоплёнки наблюдаются на поверхностях и представляют собой стойких клинических вызов из-за заражения водоемов на катетеры и в жилой устройства1,2,3.
Биопленки недавно описал несколько кишечных патогенов; бактерии, которые заражают тонкой кишки или кишечника4. Шигеллы видов, инфекции происходит в толстой кишке человека после транзитом через большинство из желудочно-кишечного тракта. Во время прохождения через кишечник шигеллы подвергается желчи; моющее средство унижающего достоинство липидов, секретируемых в кишечнике для облегчения переваривания липидов при одновременно убить большинство бактерий5. Кишечных патогенов имеет уникальную способность противостоять бактерицидный эффект желчь6. Наш недавний анализ используемых в естественных условиях-как комбинации глюкозы и желчных солей продемонстрировать надежную биопленки в S. Флекснера , а также других видов шигеллами, патогенных кишечной палочкии Сальмонелла4. Ранее, Salmonella enterica серовар Typhi было показано образуют желчь индуцированной биопленки благодаря уникальной колонизации желчного пузыря при хронической инфекции7,8,9, 10. Кроме того, предварительные исследования с Vibrio11и Campylobacter12 продемонстрировал биопленки в ответ желчи. Таким образом анализ продлил желчь индуцированной биопленки формирования замечания других патогенов и способствовать созданию демонстрации ответа сохраняется кишечных патогенов желчи. В отличие от хронической биопленки в котором транскрипции гена бактериальной ограничено и старение клеток может произойти1,2,3мы предлагаем, что кишечной биопленки желчь индуцированной более преходящими в природе. Это преходящее, вирулентным биопленки hallmarked по быстрой разборки (как видно в assay дисперсия) и повышение экспрессии генов вирулентности, наблюдается в биопленки населения4,6.
Биопленки является многогранной, динамичный процесс и использование желчных солей как инициирующего фактора только была недавно описана для наиболее кишечных патогенов, инструменты и методы, используемые как уникальный и творческий применения традиционных методов. Таким образом здесь представлены три бесплатные стратегии для количественного определения нескольких важных характеристик желчные соли индуцированной биопленки, включая бактериальные присоединения, производство EPS матрицы и дисперсия жизнеспособных бактерий от биопленки. Эти методы были использованы главным образом для исследований с шигеллезом; и поэтому, оценки других кишечных патогенов могут требовать оптимизации. Тем не менее позитивные данные из всех трех анализов поддерживают идентификация биопленки и создать воспроизводимый протоколы для соли желчных индуцированной биопленки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ биопленки является сложной задачей вследствие динамичного характера биопленки и изменчивость между штаммами, материалы, лабораторий и анализов. Здесь представлены несколько стратегий для определения биопленки в кишечных патогенов, после облучения желчных солей с эксперимент…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Rachael B. Chanin и Алехандро Льянос-Чеа для оказания технической помощи. Мы благодарим Энтони т. Maurelli, Брайан P. Херли, Алессио Fasano, Бретт э. Swierczewski и Бобби Cherayil штаммов, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний Грант K22AI104755 (РППО). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
