Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering
Summary
Dit protocol laat de lezer om te analyseren bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers met behulp van een veelzijdige aanpak om vast te leggen van het dynamische karakter van het bacteriële biofilms door beoordeling van de naleving, extracellulaire stof van polymere matrix vorming, en dispersie.
Abstract
Biofilm vorming is een dynamische, meertraps proces dat zich in bacteriën onder strenge milieu-omstandigheden of in tijden van stress voordoet. Voor zuurbestendige ziekteverwekkers, wordt een aanzienlijke stress-respons veroorzaakt gastro-intestinale onderweg en bij gal blootstelling, een normaal onderdeel van menselijke spijsvertering. Om te overwinnen de bactericide effecten van gal, vormen vele darmen ziekteverwekkers een biofilm hypothetische zodat overleven wanneer bij het transitovervoer door de dunne darm. Hier presenteren we methoden om te definiëren van biofilm vorming door naleving van de solid-phase assays evenals extracellulaire polymere stof (EPS) matrix detectie en visualisatie. Bovendien wordt biofilm dispersie beoordeling gepresenteerd waarmee de analyse van gebeurtenissen triggering release van bacteriën tijdens de infectie wordt nagebootst. Kristalviolet kleuring wordt gebruikt voor het detecteren van aanhangend bacteriën in een high-throughput 96-wells-plaat naleving assay. EPS-productie beoordeling wordt bepaald door twee tests, namelijk microscopie kleuring van de EPS-matrix en semi-kwantitatieve analyse met een polysaccharide fluorescently-geconjugeerde bindend lectine. Ten slotte wordt biofilm dispersie gemeten door middel van de graven van de kolonie en beplating. Positieve gegevens uit meerdere tests ondersteunen de karakterisatie van biofilms en kan worden gebruikt om het identificeren van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming in andere bacteriestammen.
Introduction
Biofilm formatie is een belangrijke bacteriële overlevingsstrategie geïnduceerde tijdens Barre milieu omstandigheden. Blootstelling aan bactericide verbindingen zoals antibiotica of veranderingen in voedingsstoffen of zuurstof beschikbaarheid induceert een gespannen staat in bacteriën die kan worden verlicht door vorming van biofilms. Een biofilm wordt gekenmerkt door bacteriële gehechtheid aan een oppervlak of andere bacteriën en wordt begeleid door de afscheiding van een matrix van de EPS-voornamelijk samengesteld uit polysacchariden1,2,3. Biofilm vorming is een dynamisch proces waarin een cascade van gebeurtenissen in de vorming van een volwassen aanhangend bacteriële Gemeenschap1,2,3 culmineert. Bacteriën produceren adhesines om vroege bijlage terwijl shifting adhesine gen expressieprofielen ter versterking van de bijlage tijdens biofilm rijping. EPS-productie komt tegelijkertijd jas de bacteriële Gemeenschap in een matrix te beschermen de cellen van de eerste stressor. Bacteriën die deel uitmaakt van de biofilm zijn traag groeiende; en als zodanig, maakt de meeste antibiotica ondoeltreffend. Bovendien, de trage groei bespaart energie tot omstandigheden veranderen om de gunst van de bacteriële groei1,2,3. Na de barre omstandigheden zijn verstreken, bacteriën verspreiden de biofilm en een planktonische levensstijl1,2,3te hervatten. Traditioneel, biofilms zijn waargenomen op oppervlakken en vertegenwoordigen een persistente klinische uitdaging als gevolg van infectie reservoirs aanwezig op katheters en in-woning apparaten1,2,3.
Biofilm vorming werd onlangs beschreven voor verschillende darmen ziekteverwekkers; bacteriën die de dunne darm of dikke darm4 infecteren. Voor Shigella soorten, infectie treedt op in de menselijke darm na een doorvoer over de meerderheid van het maag-darmkanaal. Tijdens de passage door de dunne darm, is Shigella blootgesteld aan gal; een lipide-vernederende wasmiddel uitgescheiden naar de darm te vergemakkelijken van vertering van lipiden terwijl het tegelijkertijd het doden van de meeste bacteriën5. Darmen ziekteverwekkers hebben een unieke vermogen om te weerstaan aan het bactericide effect van gal6. Onze recente analyse gebruikt in vivo-als combinaties van glucose en galzouten om aan te tonen van robuuste biofilm vorming in S. flexneri en andere soorten Shigella, pathogene Escherichia colien Salmonella4. Eerder, Salmonella enterica serovar Typhi bleek te vormen van een biofilm gal-geïnduceerde als gevolg van de unieke kolonisatie van de galblaas bij chronische infectie7,8,9, 10. Daarnaast voorafgaande onderzoek met Vibrio11en Campylobacter12 biofilm vorming in reactie op Gal aangetoond. Dus, de analyses uitgebreid de gal-geïnduceerde biofilm vorming opmerkingen bij andere ziekteverwekkers en helpen om de demonstratie van een reactie van de geconserveerde darmen pathogen op Gal. In tegenstelling tot chronische biofilms waarin bacteriële gene transcriptie is beperkt en cel senescentie kan het optreden van1,2,3, stellen wij voor dat de darmen, gal-geïnduceerde biofilm meer voorbijgaande aard is. Dit van voorbijgaande aard, virulente biofilm is hallmarked door een snelle demontage (zoals gezien in de dispersie-assay) en verbeterde virulentie genexpressie waargenomen in de biofilm bevolking4,6.
Zoals biofilm vorming is een veelzijdige, dynamische proces en het gebruik van galzouten zoals een activerende factor alleen al recent beschreven voor meest darmen ziekteverwekkers, zijn tools en technieken gebruikt unieke en creatieve toepassingen van traditionele methoden. Dus, hier gepresenteerd zijn drie gratis strategieën te kwantificeren van enkele belangrijke kenmerken van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming, met inbegrip van bacteriële aanhankelijkheid, productie van de EPS-matrix, en de dispersie van levensvatbare bacteriën uit de biofilm. Deze technieken hebben gebruikt voornamelijk voor onderzoek met Shigella; en daarom, evaluatie van andere zuurbestendige ziekteverwekkers optimalisatie kan vereisen. Echter positieve gegevens uit alle drie tests ondersteunen identificatie van biofilms en reproduceerbare protocollen voor bile salt-geïnduceerde biofilm vorming stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse van biofilm vorming is uitdagend vanwege de dynamische aard van biofilms en de variabiliteit tussen de stammen, materialen, laboratoria en testen. Hier zijn verschillende strategieën om te bepalen van biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers na galzouten blootstelling met experimentele inzicht geboden ter bevordering van de reproduceerbaarheid gepresenteerd. Er zijn aanvullende overwegingen om de reproduceerbaarheid. Eerst en vooral, is het raadzaam voor het uitvoeren van ten minste drie onafhankelijke expe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Rachael B. Chanin en Alejandro Llanos-Chea voor technische bijstand. Wij danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski en Bobby Cherayil voor de spanningen in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten Grant K22AI104755 (C.S.F.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
