تشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية: تقنيات لتحديد وتقدير حجم
Summary
هذا البروتوكول يتيح للقارئ لتحليل تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية باستخدام نهج متعدد الأوجه لالتقاط الطابع الدينامي للأغشية الحيوية البكتيرية بتقييم التقيد بتشكيل المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر، والتشتت.
Abstract
تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية ومتعددة المراحل التي تحدث في البكتيريا تحت ظروف بيئية قاسية أو أوقات الشدة. لمسببات الأمراض المعوية، هو فعل استجابة كبيرة من إجهاد أثناء العبور الجهاز الهضمي وعند التعرض الصفراء، عنصرا عادياً من الهضم البشرية. للتغلب على آثار جراثيم الصفراء، تشكل العديد من مسببات الأمراض المعوية بيوفيلم العينة للسماح بالبقاء على قيد الحياة عندما تمر عبر الأمعاء. وهنا يقدم منهجيات تحديد تشكيل بيوفيلم عن طريق فحوصات الالتزام المرحلة الصلبة، فضلا عن كشف المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر (EPS) والتصور. وعلاوة على ذلك، يرد بيوفيلم تشتت التقييم لتقليد تحليل الأحداث التي تسبب إطلاق سراح بكتيريا أثناء عملية العدوى. صبغة الكريستال البنفسجي يستخدم للكشف عن البكتيريا ملتصقة في مقايسة التزام الفائق 96-جيدا لوحة. تقييم إنتاج EPS يتحدد بفحوصات اثنين، هما مجهرية تلطيخ مصفوفة EPS وتحليل شبه كمي مع يكتين ملزمة السكاريد مترافق فلوريسسينتلي. وأخيراً، وتشتت بيوفيلم يقاس من خلال التهم مستعمرة والطلاء. بيانات إيجابية من فحوصات متعددة دعم توصيف الأغشية الحيوية، ويمكن أن تستخدم لتحديد تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في السلالات البكتيرية الأخرى.
Introduction
تشكيل بيوفيلم استراتيجية بقاء بكتيرية هامة التي يسببها خلال الظروف البيئية القاسية. التعرض لمركبات جراثيم مثل المضادات الحيوية أو التغييرات في المغذيات أو توافر الأوكسجين يدفع دولة أكد في البكتيريا التي يمكن تخفيفها من خلال تشكيل بيوفيلم. بيوفيلم يتسم بمرفق البكتيرية إلى سطح أو غيرها البكتيريا ومصحوبا بإفراز مصفوفة EPS تتألف أساسا من السكريات1،،من23. تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية الذي يتوج سلسلة أحداث في تشكيل مجتمع ناضج بكتيرية ملتصقة1،2،3. البكتيريا تنتج أدهيسينس لتيسير مرفق المبكر بينما تتحول ملامح التعبير الجينات أدهيسين لتعزيز مرفق أثناء النضج بيوفيلم. في الوقت نفسه، يحدث إنتاج EPS إلى معطف المجتمع البكتيري في مصفوفة لحماية الخلايا من الضغوطات الأولية. البكتيريا الواردة داخل بيوفيلم هي بطيئة النمو؛ وعلى هذا النحو، يجعل معظم المضادات الحيوية غير فعالة. وعلاوة على ذلك، يحفظ بطء نمو الطاقة حتى تتغير الظروف لصالح النمو البكتيري1،،من23. بعد أن مرت ظروف قاسية، تفريق بيوفيلم البكتيريا واستئناف حياة العوالق1،2،3. تقليديا، الأغشية الحيوية لوحظت على السطوح وتمثل تحديا سريرية مستمرة سبب الإصابة الخزانات الحالية في القسطرة وفي مسكن الأجهزة1،،من23.
ووصفت تشكيل بيوفيلم مؤخرا لعدة مسببات الأمراض المعوية؛ البكتيريا التي تصيب الأمعاء الدقيقة أو القولون4. للأنواع دوسنتاريا ، العدوى يحدث في القولون البشرية بعد عبور من خلال معظم الجهاز الهضمي. أثناء المرور عبر الأمعاء الدقيقة، يتعرض دوسنتاريا الصفراء؛ منظفات اللاإنسانية الدهن ويفرز في الأمعاء لتسهيل الهضم الدهون بينما قتل معظم البكتيريا5في وقت واحد. مسببات الأمراض المعوية بقدرة فريدة على مقاومة آثار جراثيم الصفراء6. استخدام لدينا التحليل مؤخرا في فيفو–مثل تركيبات من الجلوكوز وأملاح الصفراوية لإثبات تكوين بيوفيلم قوية في فليكسنيري س. وكذلك الأنواع الأخرى المسببة للأمراض دوسنتاريا، الإشريكيّة القولونية، و السالمونيلا4. سابقا، سرفار انتيريكا السالمونيلا التيفية أبدى لتشكيل بيوفيلم المستحثة الصفراوية بسبب استعمار فريدة من المرارة أثناء العدوى المزمنة7،،من89، 10. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت البحوث السابقة مع الضمة11والعطيفه12 بيوفيلم تشكيل استجابة الصفراء. ولذلك، التحليلات الموسعة الملاحظات تشكيل بيوفيلم المستحثة الصفراء لمسببات الأمراض الأخرى وتساعد في إقامة مظاهرة رد الممرض المعوي يحافظ على الصفراء. خلافا للأغشية الحيوية المزمنة التي الجينات البكتيرية النسخ محدودة ويمكن أن تحدث الشيخوخة الخلية1،2،3، نقترح أن بيوفيلم التي يسببها الصفراوية المعوي أكثر عابرة في الطبيعة. هذه العابرة، بيوفيلم ضراوة هو المدموغة بتفكيك سرعة (كما رأينا في تحليل التشتت) وتعزيز التعبير الجيني الفوعة لوحظت في4،السكان بيوفيلم6.
كما تشكيل بيوفيلم هو عملية متعددة الأوجه، ودينامية، واستخدام أملاح الصفراوية كعامل التفجير تم وصف مؤخرا لمسببات الأمراض المعوية الأكثر فقط، الأدوات والتقنيات المستخدمة تطبيقات فريدة من نوعها ومبتكرة من الأساليب التقليدية. وهكذا، المعروضة هنا ثلاث استراتيجيات مجانية لقياس العديد من الخصائص الهامة لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية، بما في ذلك التقيد البكتيرية، إنتاج مصفوفة EPS، وتشتت من البكتيريا قادرة على البقاء من بيوفيلم. وقد استخدمت هذه التقنيات أساسا للبحث مع دوسنتاريا؛ وبالتالي، تقييم مسببات الأمراض المعوية الأخرى قد تتطلب التحسين. ومع ذلك، بيانات إيجابية من جميع الاختبارات الثلاثة دعم تحديد الأغشية الحيوية ووضع بروتوكولات استنساخه لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل تكوين بيوفيلم يشكل تحديا نظراً للطابع الدينامي للأغشية الحيوية والتباين بين السلالات، والمواد والمختبرات وفحوصات. هنا، يتم عرض عدة استراتيجيات لتحديد تكوين بيوفيلم في مسببات الأمراض المعوية عقب التعرض لأملاح الصفراوية مع البصيرة التجريبية المقدمة لتعزيز إمكانية تكرار نتائج. هنا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر راشيل باء كنين واليخاندرو يانوس-شيا للمساعدة التقنية. ونحن نشكر أنطوني ت. مورلي، هيرلي ص بريان، اليسيو Fasano، سويركزيوسكي هاء بريت وشيريل بوبي للسلالات المستخدمة في هذه الدراسة. كان يدعمها هذا العمل “المعهد الوطني للحساسية” والأمراض المعدية منحة K22AI104755 (C.S.F.). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
