カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ
Summary
このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング ベースのメソッド。
Abstract
カスパーゼのプロテアーゼ族は、アポトーシスと自然免疫で重要な役割を再生します。これらのうち、イニシエーター ・ カスパーゼと呼ばれるサブグループこれらの経路でアクティブにする最初のです。このグループ含まれてカスパーゼ-2,-8,-9 と炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、-4 と-5。イニシエーター ・ カスパーゼはすべて活性化プラットフォームと呼ばれる特定の多蛋白質複合体への募集、次二量体化によって活性化します。カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) は、カスパーゼはイニシエーター カスパーゼの活性化プラットフォームや結果に募集を視覚化に使用されるイニシエーターに溶ける蛍光蛋白質を分割イメージング ベースのアプローチ誘導近接。この蛍光は、イニシエーター ・ カスパーゼ活性化のために必要な初期手順の 1 つの読み出しを提供します。異なる顕微鏡ベースのアプローチの数を使用して、このテクニックがカスパーゼ活性化のサイズとカスパーゼ活性化の数の速度と同様に、人口レベルでカスパーゼ活性化の効率の定量的データを提供できます。セルごとに複合体。
Introduction
カスパーゼのプロテアーゼ家族はアポトーシスと免疫1における重要な役割を知られています。重要性のため決定するとき、どこで、どのように効率的に特定のカスパーゼを活性活性化経路カスパーゼのメカニズムに重要な洞察力を提供することができます。ここで説明したイメージング ベースのプロトコルは、カスパーゼ活性化カスケードの最も早いステップの可視化を実現。 にします。この手法は動的蛋白質: 蛋白質の相互作用のドライブのカスパーゼ活性化で活用します。
カスパーゼは、2 つのグループに分けることができます: イニシエーター ・ カスパーゼ (カスパーゼ-1、-2、-4、-5、-8,-9,-10-12) と死刑執行カスパーゼ (カスパーゼ-3、-6、-7)。死刑執行カスパーゼは、前もって形成された二量体として細胞内に存在、大小サブユニット2間の乖離によってアクティブ化されます。アクティブになったとき、彼らはアポトーシス3の結果を多くの構造および調節蛋白質を切断します。イニシエーター ・ カスパーゼは最初カスパーゼ経路でアクティブにし、一般に死刑執行カスパーゼの活性化を誘発します。死刑執行のカスパーゼとは対照的イニシエーター ・ カスパーゼは二量体化4,5によってアクティブ化されます。この二量体は、活性化のプラットフォームとして知られている特定の大きな分子量複合体に非アクティブなモノマーの採用によって促進されます。活性化プラットフォームのアセンブリは、特定の蛋白質: 蛋白質の相互作用のシリーズによって支配されます。これらは、保存されている蛋白質相互作用モチーフ proform イニシエーター ・ カスパーゼの存在によって仲介される、死ドメイン (DD)、死のエフェクター ドメイン (DED) およびカスパーゼ募集ドメイン (カード) 6 (図 1 a)。活性化のプラットフォームは、受容体タンパク質とアダプター蛋白質に通常含まれます。受容体は、リガンドの結合するにより、多数の分子の重合における立体構造変化を誘発する有効になります。受容体、どちらかを募集するカスパーゼ直接または順番に、カスパーゼをもたらす複雑なアダプター分子。したがって、多数のカスパーゼ分子二量体化を許可する近接になります。これは誘導近接モデル7として知られています。二量化、一度、カスパーゼ活性酵素4,8を安定させるのに役立つ自動処理を受けます。たとえば、Apaf1 アポトソームのアセンブリは、シトクロム c がミトコンドリアの外膜透過 (MOMP) と呼ばれるプロセス内のミトコンドリアからのリリースで、以下によってトリガーされます。Apaf1 は、順番カードの両方のタンパク質9の存在によって媒介される相互作用を介してカスパーゼ 9 を募集します。同じような蛋白質の相互作用は、CD95 死の複雑なシグナルを誘導する (ディスク); カスパーゼ 8 の活性化につながるアセンブリカスパーゼ-2; をアクティブにすることができます PIDDosome様々 なインフラマソーム錯体カスパーゼ 1 の活性化10、11,12を開始します。したがって、イニシエーター ・ カスパーゼは、誘起近接と二量体化、活性化は発生しませんなしに共通のメカニズムによって特定の活発化のプラットフォームに募集しています。
カスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC) はまずこのイニシエーター カスパーゼの活性化を測定するために開発されたイメージング ベースのアッセイ カスパーゼによる近接活性化プラットフォームを次の直接可視化が可能アセンブリ。このメソッドは、分割蛍光タンパク質金星の性質を活用します。金星は明るく、2 つの非蛍光性と少し重複フラグメントに分割でき、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) のより多くのあるバージョン: ヴィーナス (金星 N または VN) と金星 (ヴィーナス C または VC) の C 末端の N 末端。これらのフラグメントは、フォールディングし、近接13時に蛍光になる能力を保持します。金星の各フラグメントは、カスパーゼ活性化プラットフォームへのバインドの最小の部分であるカスパーゼの prodomain に融合されます。これにより、カスパーゼ酵素活性は保持されません、したがって内因性イベントに関連付けられているダウン ストリーム イベントの同時分析が可能です。金星の断片フォールディング カスパーゼ prodomains 活性化プラットフォームを採用し、誘起近接を受けるとき。(図 1 b)。金星の生じる蛍光性は、正確かつ具体的に細胞レベル下のローカリゼーション、速度、および単一細胞におけるイニシエーター カスパーゼ活性化プラットフォームのアセンブリの効率を監視する使用できます。標準蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡で得ることができる画像データとを含む各種の顕微鏡のアプローチの数を合わせることができる: リアルタイムでカスパーゼ活性化を追跡するタイムラプス イメージング細胞レベル下のローカリゼーションの正確な決定のための高分解能イメージング終点の活性化効率の定量化。
この手法は、カスパーゼ 214の活性化を調査する最初に開発されました。2 カスパーゼの活性化のプラットフォームは、PIDDosome と考えられている中から成る PIDD (死ドメインと p53 誘導された蛋白質) 受容体とアダプター RAIDD (RIP 関連する ICH-1/CAD-3 死ドメインの相同タンパク質)、PIDDosome 独立 caspase-2 活性化が報告されています。カスパーゼ 2 追加のアクティブ化プラットフォームに15、16が存在することが示唆されました。カスパーゼの活性化プラットフォームの完全なコンポーネントを知らず、にもかかわらずカスパーゼ BiFC 法はカスパーゼ 2 シグナル伝達経路の分子レベル14,17の成功の尋問のため許可されています。我々 はまた、正常に炎症性カスパーゼ (カスパーゼ-1、-4、-5、-12) この議定書を適応している18と、原則として、同じアプローチは、同様に残りのイニシエーター ・ カスパーゼのそれぞれを分析するのに十分なはず。このプロトコルは、合わせることができる同様に二量体化が主要な活性化信号が他の経路を調査します。例えば、Janus のキナーゼ (JAK) 19によってリン酸化、次二量体化 STAT 蛋白質が活性化します。したがって、STAT の活性化だけでなく、動的蛋白質の相互作用によって調整される他の多くの経路を視覚化する BiFC システムを使用可能性があります。次のプロトコルは、画像集録および解析のためのセルに記者の導入のための手順や方法論を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、カスパーゼによる近接を測定する蛍光タンパク質を分割の使用について説明します。それは非常に明るく、非常にあると、巻き戻しである高速13分割金星この方法を選ばれました。したがって、カスパーゼ タンパク質相互作用ダイナミクスの実時間推定に近い金星カスパーゼによる近接時に巻き戻しの分析を提供できます。金星は金星 (ヴィーナス N ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この技術の開発に貢献した Bouchier ・ ヘイズ ラボのすべての前メンバーを確認したいと思います。この仕事の一部 LBH テキサス子供病院小児パイロット賞によって資金を供給されました。Joya チャンドラ (MD アンダーソン、ヒューストン、テキサス州) は、彼女のチームと共同で公開されているデータを含むようにアクセス許可を感謝いたします。記述されている試薬の開発は NIH (NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 傘下 S10RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の援助からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別コアによって支えられました。
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
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