Illuminant les voies à l’Activation des caspases utilisant la Fluorescence bimoléculaire complémentation

La famille de protéases de caspase est connue pour leur rôle essentiel dans l’apoptose et l’immunité innée ¹. En raison de leur importance, déterminer quand, où et comment efficacement des caspases sont activés peut apporter un éclairage crucial sur les mécanismes de la caspase voies d’activation. Le protocole de base d’imagerie décrit ici permet la visualisation des premières étapes dans la cascade d’activation de la caspase. Cette technique tire parti des interactions dynamiques : la protéine cette activation de caspases en voiture.

Les caspases peuvent être divisés en deux groupes : les caspases initiateur (caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 et -12) et les caspases bourreau (caspase-3, -6 et -7). Les caspases bourreau sont présents dans la cellule comme dimères préformés et sont activés par un clivage entre la grande et petite sous-unité ². Lorsqu’il est activé, ils fendent de nombreuses protéines structurelles et réglementaires, aboutissant à l’apoptose ³. Les caspases initiateur sont les caspases premières pour être activé dans une voie généralement déclencher l’activation des caspases bourreau. Contrairement au bourreau caspases, initiateur caspases sont activés par dimérisation ^4,5. Cette dimérisation est facilitée par le recrutement de monomères inactifs pour spécifique grand poids moléculaire complexes appelées plates-formes d’activation. Assemblée des plates-formes d’activation est régie par une série d’interactions de protéine : protéine spécifique. Ceux-ci sont médiés par des motifs d’interaction protéine conservée présents dans le proform de la caspase initiatrice et incluent le domaine mort (DD), le domaine effecteur de mort (DED) et la caspase recrutement domaine (carte) ⁶ (Figure 1 a). Plates-formes d’activation incluent généralement une protéine réceptrice et une protéine adaptatrice. Habituellement, le récepteur est activé lors de la liaison d’un ligand, induisant un changement conformationnel permettant l’oligomérisation de nombreuses molécules. Le receveur recrute alors soit la caspase directement ou les molécules d’adaptateur qui à son tour apportent la caspase au complexe. Ainsi, les nombreuses molécules de caspase entrent en proximité permettant une dimérisation. Ceci est connu comme le modèle de proximité induite par ⁷. Une fois que les mélanges, la caspase subit une autoprocessing, qui sert à stabiliser l’enzyme active ^4,8. Par exemple, l’Assemblée de l’apoptosome Apaf1 est déclenchée par le cytochrome c, suite à sa sortie de la mitochondrie dans un processus appelé la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP). Apaf1 recrute à son tour caspase-9 grâce à une interaction qui est véhiculée par une carte présente dans les deux protéines ⁹. Résultat des interactions protéine similaire dans l’Assemblée de la mort CD95 induisant la signalisation complexe (disque) qui mène à l’activation de la caspase-8 ; le PIDDosome, qui peut activer la caspase-2 ; et divers complexes inflammasome qui initie l’activation de la caspase-1 ^10,11,12. Ainsi, initiateur caspases sont recrutés aux plates-formes d’activation spécifique par un mécanisme commun aboutissant à proximité induite et une dimérisation, sans laquelle activation ne se produira pas.

Complémentation de Fluorescence bimoléculaire caspase (BiFC) est une analyse axée sur l’imagerie qui a été développée pour mesurer cette première étape de l’activation des caspases initiateur, ce qui permet une visualisation directe de la proximité de caspases induite par suite de plateforme d’activation Assemblée. Cette méthode tire parti des propriétés de la protéine fluorescente split Venus. Vénus est un plus brillant et plus version photostable de la protéine fluorescente jaune (YFP) qui peut être séparé en deux fragments non fluorescent et légèrement superposées : l’extrémité N-terminale de Vénus (Venus N ou VN) et l’extrémité C-terminale de Vénus (Venus C ou VC). Ces fragments conservent la possibilité de replier et devient fluorescent lorsqu’à proximité ¹³. Chaque fragment de Vénus est fusionnée à la prodomain de la caspase, c’est-a-dire la portion minimale de la caspase qui se lie à la plateforme d’activation. Cela garantit que les caspases ne conservent pas l’activité enzymatique et par conséquent une analyse concomitante des événements en aval associés aux événements endogènes est possible. La Vénus des fragments repli quand les caspase prodomains sont recrutés à la plateforme d’activation et subissent une proximité induite. (Figure 1 b). La fluorescence de Vénus qui en résulte peut être utilisée avec précision et plus particulièrement surveiller la localisation subcellulaire, la cinétique et l’efficacité de l’Assemblée d’initiator caspase activation plates-formes dans des cellules individuelles. Données d’imagerie peuvent être acquises par microscopie confocale ou par microscopie de fluorescence standard et peut être adaptée à un certain nombre d’approches différentes de la microscopie, y compris : imagerie Time-lapse pour suivre l’activation de la caspase en temps réel ; imagerie à haute résolution pour des déterminations précises de localisation sous-cellulaire ; et la quantification de point de terminaison de l’efficacité de l’activation.

Cette technique a été développée afin d’étudier l’activation de la caspase-2¹⁴. Tandis que la plate-forme d’activation de la caspase-2 est considérée comme le PIDDosome, composé du récepteur PIDD (induite par la p53 protéine avec un domaine de mort) et l’adaptateur RAIDD (protéines homologues RIP-associated ICH-1/CAD-3 avec un domaine de mort), Activation de caspase-2 PIDDosome-indépendant a été signalée. Ceci suggère que les plates-formes d’activation supplémentaire pour caspase-2 existent ^15,16. Malgré ne connaissant pas les composants complètes de la plate-forme d’activation de la caspase-2, la caspase BiFC technique a laissé pour interrogatoire réussie des voies de signalisation caspase-2 au niveau moléculaire ^14,17. Nous avons également adapté ce protocole pour les caspases inflammatoires (caspase-1, -4, -5 et -12) ¹⁸ et, en principe, la même approche devrait être suffisante pour analyser de la même façon chacun des caspases initiateur restants. Ce protocole pourrait de même être adapté pour étudier d’autres voies ont été dimérisation est un important signal activant. Par exemple, les protéines STAT sont activés par dimérisation après phosphorylation par Janus kinase (JAK) ¹⁹. Ainsi, le système de BiFC pourrait servir à visualiser pour activation STAT ainsi que plusieurs autres sentiers réglementés par des interactions de protéine dynamique. Le protocole suivant fournit des instructions détaillées pour la mise en place des journalistes dans les cellules, ainsi que des méthodologies d’analyse et d’acquisition d’images.