מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה
Summary
פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.
Abstract
משפחת קספאז של פרוטאזות ממלאים תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות. בין אלה, קבוצת משנה המכונה יוזם caspases הם הראשונים להיות מופעל בתוך המסלולים הללו. קבוצה זו כוללת קספאז-2-8, ו-9, וכן את caspases דלקתיות, קספאז-1, ארבע, ו-5. Caspases המאתחל כולם מופעלים על ידי dimerization בעקבות גיוס קומפלקסים multiprotein ספציפי שנקרא הפעלת פלטפורמות. קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) היא גישה מבוססת הדמיה איפה לפצל חלבונים פלורסנט דבוקה יוזם caspases משמשים כדי להמחיש את גיוס יוזם caspases פלטפורמות הפעלה שלהם, וכתוצאה מכך הקרבה המושרה. קרינה פלואורסצנטית הזה מספק את הבדיקה של אחד השלבים המוקדמים הנדרשים להפעלת קספאז יוזם. שימוש במספר גישות שונות מבוסס מיקרוסקופיה, טכניקה זו יכולה לספק נתונים כמותיים על היעילות של קספאז הפעלה ברמת האוכלוסייה, כמו גם את קינטיקה של קספאז ההפעלה ואת גודל מספר קספאז מפעיל מתחמי על בסיס לכל תא.
Introduction
משפחת פרוטאז קספאז ידועים שלהם תפקידים חיוניים אפופטוזיס, מולדת חסינות 1. בשל חשיבותם, קביעה מתי, היכן, באיזו מידת יעילות caspases ספציפי מופעלים יכול לספק תובנות מנגנוני קספאז מכריע הפעלה מסלולים. פרוטוקול מבוסס הדמיה המתוארים כאן מאפשר את החזיית בשלבים המוקדמים קספאז הפעלת המפל. טכניקה זו לוקח את היתרונות של אינטראקציות חלבון דינמי: הפעלת קספאז באותו כונן.
Caspases ניתן לחלק לשתי קבוצות: caspases המאתחל (קספאז-1,-2,-4,-5, -8,-9,-10 ו-12), את caspases התליין (קספאז-3,-6 ו-7). Caspases התליין נמצאים בתא כמו הדימרים preformed, מופעלים על-ידי פצילות בין יחידת משנה קטנים וגדולים 2. כשהוא מופעל, הם קליב חלבונים מבניים ותקינה רבים וכתוצאה מכך אפופטוזיס 3. Caspases המאתחל הן caspases הראשונה תופעל ב מסלול, בדרך כלל להפעיל את ההפעלה של caspases התליין. בניגוד caspases התליין, יוזם caspases מופעלים על ידי 4,dimerization5. Dimerization הזה הוא הקל על ידי גיוס של מונומרים לא פעיל כדי מתחמי משקל מולקולרי גדול ספציפי ידוע as פלטפורמות הפעלה. הרכבה של פלטפורמות הפעלה נשלטת על ידי סדרה של אינטראקציות חלבון: חלבון ספציפי. אלה מתווכת על ידי מוטיבים אינטראקציית חלבון שנשמרת נוכח proform של קספאז המאתחל, כוללים את תחום המוות (DD), תחום אפקטור מוות (DED) קספאז גיוס לתחום (כרטיס) 6 (איור 1 א’). פלטפורמות הפעלה כוללים בדרך כלל חלבון קולטן וחלבון של מתאם. הקולטן מופעל בדרך כלל בעת איגוד של ליגנד, וגורם לשינוי הסתגלותי המאפשר oligomerization של מולקולות רבות. הקולטן ואז גם מגייס את קספאז ישירות או מולקולות מתאם בתורו להביא את קספאז המתחם. לפיכך, מולקולות קספאז רבים להיכנס בסמיכות המתיר dimerization. זה נקרא את המודל של קרבה המושרה 7. ברגע dimerized, קספאז עובר עיבוד אוטומטי, אשר משמש כדי לייצב את האנזים פעיל 4,8. לדוגמה, הרכבה של apoptosome Apaf1 המופעלת על-ידי ציטוכרום c בעקבות השקתו של המיטוכונדריה בתהליך הקרוי הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי permeabilization (MOMP). Apaf1 מגייס בתורו קספאז-9 על-ידי אינטראקציה זה מתווך על ידי כרטיס נוכחות שני חלבונים 9. אינטראקציות חלבון דומה לגרום ההרכבה של CD95 המוות גרימת איתות מורכבים (דיסק) שמוביל הפעלה קספאז-8; PIDDosome, אשר ניתן להפעיל קספאז-2; מתחמי inflammasome שונים כי ליזום הפעלה קספאז-1 10,11,12. לפיכך, יוזם caspases מגויסים כדי פלטפורמות הפעלה ספציפית ע י מנגנון משותף וכתוצאה מכך מושרה הקרבה, dimerization, אשר בלעדיו לא יתרחש הפעלה.
קספאז ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה קרינה פלואורסצנטית (BiFC) הוא assay מבוססת הדמיה שפותחה כדי למדוד את זה הצעד הראשון בהפעלת caspases היוזם, ומאפשר פריט חזותי ישיר של הגיינה קספאז הנגרמת בעקבות הפעלת פלטפורמה הרכבה. שיטה זו מנצלת המאפיינים של החלבון הניאון פיצול ונוס. ונוס היא של יותר ויותר בהיר יותר photostable גירסה של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי ניתן להפריד לשני מקטעים שאינם-פלורסנט, מעט חופפים: N-הסופית של נוגה (ונוס N או VN) ו- C-הסופית של נוגה (ונוס C או VC). קטעים אלה שומרים על היכולת לקפל ולהפוך פלורסנט כאשר אתה נמצא בסמיכות 13. כל שבר ונוס היא דבוקה prodomain של קספאז, המהווה החלק מינימלי של קספאז המאגד פלטפורמת הפעלה. פעולה זו מבטיחה כי caspases אינם שומרים על פעילות אנזימטיות, לכן ניתוח בו-זמניות של הזרם באירועים המשויכים אירועים אנדוגני הוא אפשרי. . ונוס קטעים לקפל כאשר prodomains קספאז גייסו פלטפורמת הפעלה ומבצעת קרבה המושרה. (איור 1B). קרינה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך ונוס ניתן לעקוב במדויק, במיוחד ההתאמה subcellular, קינטיקה של, ואת היעילות של הרכבה של יוזם קספאז פלטפורמות הפעלה של תאים בודדים. הדמיה נתונים ניתן לרכוש על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית או על-ידי קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ, ניתן להתאים מספר גישות מיקרוסקופיה שונים כולל: הדמיה בצילום מואץ כדי לעקוב אחר קספאז הפעלה בזמן אמת; הדמיה ברזולוציה גבוהה עבור מדויק ועיונם לוקליזציה subcellular; נקודת הקצה כימות של היעילות של ההפעלה.
שיטה זו פותחה לראשונה כדי לחקור את ההפעלה של קספאז-214. בעוד הפלטפורמה הפעלה קספאז-2 נחשב להיות PIDDosome, המורכב של הקולטן PIDD (חלבון p53-induced עם תחום המוות), את מתאם RAIDD (RIP-הקשורים ICH-1/CAD-3 הומולוגי חלבון עם תחום המוות), דווח PIDDosome תלויית הפעלה קספאז-2. הדבר מצביע על כי פלטפורמות הפעלה נוספים קספאז-2 קיימים 15,16. למרות הידיעה הרכיבים המלאה של פלטפורמת הפעלה קספאז-2, אפשרה קספאז טכניקה BiFC לחקירה מוצלחת של המסלולים איתות קספאז-2 של ה ברמה המולקולרית 14,17. אנחנו גם בהצלחה הסתגלו פרוטוקול זה עבור caspases דלקתיות (קספאז-1, ארבע,-5 ו-12) 18 , בעקרון, אותה גישה צריך להספיק באופן דומה לנתח את כל caspases יוזם הנותרים. פרוטוקול זה דומה יכול להיות מותאם כדי לחקור את המסלולים אחרות היו dimerization הוא אות הפעלת מרכזי. לדוגמה, חלבונים STAT מופעלים על ידי dimerization בעקבות זרחון יאנוס קינאז (JAK) 19. לפיכך, מערכת BiFC יכול לשמש כדי להמחיש הפעלת STAT, כמו גם משעולים רבים אחרים מוסדר על ידי אינטראקציות חלבון דינמי. פרוטוקול הבאים מספק הוראות מפורטות על כניסתה של הכתבים לתוך תאים, כמו גם שיטות עבור ייבוא תמונות וניתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה דן השימוש של חלבונים פלורסנט מפוצל כדי למדוד את קספאז המושרה קרבה. פיצול ונוס נבחרה עבור טכניקה זו כי הוא בהיר מאוד, מאוד photostable, את refolding הוא מהיר 13. לפיכך, הניתוח של ונוס refolding על קרבה קספאז המושרה יכול לספק קרוב אומדנים בזמן אמת של קספאז חלבון אינטראקציה דינמיקה. ונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות כל הקודם חברי המעבדה Bouchier-הייז שתרמו להתפתחות של טכניקה זו. עבודה זו מומן בחלקו על ידי פרס טייס בילדים בבית החולים לילדים טקסס אנא צרו קשר. אנו מודים צ’אנדרה Joya (MD אנדרסון, יוסטון, טקסס) על הרשאה לכלול נתונים לאור בשיתוף עם הצוות שלה. התפתחות ריאגנטים תיאר נתמך על ידי Cytometry התא מיון הליבה ביילור לרפואה במימון NIH (NIAID P30AI036211, NCI P30CA125123 ו NCRR S10RR024574), הסיוע של ג’ואל מ Sederstrom
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
References
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
