Summary

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Published: June 09, 2018
doi:

Summary

מחקרים אובדן-של-הפונקציה המקובלת של גנים באמצעות ההסתרה חיות לעתים קרובות היו יקרים ולגזול. מבוסס-אלקטרופורציה בתיווך CRISPR סומאטית מוטגנזה מכוונת הוא כלי רב עוצמה כדי להבין ג’ין פונקציות בתוך vivo. כאן, אנחנו מדווחים על שיטה לנתח נוקאאוט פנוטיפים מתרבים תאים של הצרבלום.

Abstract

מום מוחי לעיתים קרובות נגרמת על ידי מוטציות גנטיות. פיענוח מוטציות ברקמות נגזר החולה זיהה פוטנציאל הגורמים הסיבתיים של המחלות. כדי לאמת את התרומה של תפקוד של גנים שעברו מוטציה להתפתחות המחלה, הדור של מודלים נשיאת מוטציות היא הגישה ברור אחד. בעוד מהונדסים גנטית germline העכבר מודלים (GEMMs) הם כלים ביולוגי פופולרי ולהציג תוצאות לשחזור, הוא מוגבל על-ידי זמן ועלויות. בינתיים, שאינם germline GEMMs לעיתים קרובות להפעיל פונקציה ג’ין לחקר באופן יותר ריאלי. מאז כמה המוח מחלות (למשל, גידולים במוח) מופיעים כתוצאה סומאטית אך לא germline מוטציות, שאינם germline chimeric העכבר מודלים, שבו תאים תקינה ולא תקינה לדור בכפיפה אחת, יכול להיות מועיל עבור ניתוח מחלות רלוונטיות. במחקר זה, אנו מדווחים על שיטה אינדוקציה של מוטציות סומאטית בתיווך CRISPR המוח הקטן. באופן ספציפי, אנחנו מנוצל מותנה בטוק עכברים, שבו Cas9 ו- GFP כרוני מופעלים על ידי האמרגן חטיבתי (CMV משפר/עוף ß-אקטין) לאחר Cre-מתווכת רקומבינציה של הגנום. בעיצוב עצמי יחיד-מדריך RNAs (sgRNAs) ואת הרצף recombinase Cre, שניהם המקודדת בונה פלסמיד יחיד, נשלחו לתוך גזע אסטרוציטומה/ובתאים בשלב העוברי באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . כתוצאה מכך, תאים transfected ותאי הבת שלהם הודבקו תוויות עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), למוצא פנוטיפי ניתוחים נוספים. ומכאן, שיטה זו היא לא רק מציג המסירה הגן מבוססת-אלקטרופורציה לתוך תאים עובריים אסטרוציטומה אלא גם מציע גישה כמותית מוזרה להעריך בתיווך CRISPR פנוטיפים אובדן-של-פונקציה.

Introduction

המוח המחלות הן אחת ממחלות איומות ביותר בן תמותה. הם לעתים קרובות תוצאה של מוטציות גנטיות, dysregulation עוקבות. כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של מחלות המוח, נצחית מאמצים כדי לפענח את הגנום של בני אדם חולים גילו מספר גנים סיבתי פוטנציאליים. עד כה, חייתיים germline מהונדסים גנטית כבר נעזרו ויוו רווח-של-פונקציה (GOF) וניתוחים אובדן-של-פונקציה (LOF) של גנים כאלה המועמד. עקב התפתחות מואצת של לימודי אימות פונקציונלי, רצוי ריאלי וגמישה יותר ויוו ג’ין assay מערכת לימוד ג’ין פונקציה.

היישום של מערכת העברת גנים מבוססת-אלקטרופורציה ויוו למוח המתפתח העכבר מתאים למטרה זו. למעשה, מספר מחקרים באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה הראו את הפוטנציאל שלהם לערוך ניתוחים פונקציונליים לפיתוח המוח1,2,3. למעשה, במספר אזורים במוח העכבר, כגון קליפת המוח4, רשתית העין5, diencephalon6, hindbrain7, מוח מאורך8וכן השדרה9 סומנו על ידי המסירה הגן סומאטית . מתקרב, עד כה.

אכן, ביטוי גנים ארעי על-ידי ויוו אלקטרופורציה על מוח העכבר מתחלקים שימש זמן לניתוח GOF. טכנולוגיות מבוססות transposon אינטגרציה הגנומי האחרונות נוסף זמין לטווח ארוך ו/או תנאי ביטוי של גנים של ריבית10,11, אשר מהווה יתרון לנתח ג’ין פונקציה בצורה מרחבית טמפורלית במהלך פיתוח. בניגוד GOF ניתוח, ניתוח LOF כבר יותר מאתגר. בזמן ארעי תרביות תאים של siRNAs, נושא shRNA פלסמידים בוצעה, השפעות ארוכות טווח של LOF של גנים לא מובטח בשל ההשפלה בסופו של דבר exogenously הציג חומצות גרעין, כגון פלסמידים ו- dsRNAs. עם זאת, הטכנולוגיה CRISPR/רשויות אישורים מספק של פריצת דרך LOF בניתוח. גנים קידוד חלבונים פלורסנט (למשל, ה-GFP) או חלבונים מייצרים אור (למשל, גחלילית לוציפראז) יש כבר transfected במשותף עם CRISPR-Cas9 sgRNAs כדי לסמן את התאים חשופים CRISPR Cas9-בתיווך מוטציות סומאטית. יחד עם זאת, גישה זו אולי יש מגבלות במחקרים פונקציונלי על תאים מתרבים מאז סמן אקסוגני גנים מדולל והשפילו לאחר התפשטות לטווח ארוך. בעוד התאים transfected ותאי הבת שלהם לעבור מוטציות CRISPR-induced הגנום שלהם, טביעות הרגליים שלהם אולי תלך לאיבוד לאורך זמן. לפיכך, גישות תיוג גנטי יהיה מתאים להתגבר על בעיה זו.

לאחרונה פיתחנו שיטה המבוססת על CRISPR LOF בתאים גרגר אסטרוציטומה עוברים התפשטות לטווח ארוך במהלך שלהם בידול12. להוספת תווית גנטית התאים transfected, אנו נבנה על פלסמיד נושא של sgRNA יחד עם Cre , מוחדרים פלסמיד את cerebella של עכברים Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP13 באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . בניגוד וקטורים פלסמיד רגיל קידוד EGFP, גישה זו בהצלחה עם התווית גרגר transfected נוירון מבשרי (GNPs) ותאי הבת שלהם. שיטה זו מספקת תמיכה גדולה בהבנת ויוו התפקוד של הגנים של עניין מתרבים תאים המוח נורמלי ופיתוח רקע הגידול נוטה.

Protocol

כל הניסויים נערכו לפי תקנות רווחת בעלי חיים, אושרו על ידי רשויות אחראי (Regierungspräsidium קרלסרוהה, אישור מספרים: G90/13 G176/13, G32/14, G48/14, G133/14). 1. ליצור pU6-sgRNA-Cbh-Cre פלסמידים לעצב את sgRNA למטרה ג’ין-של-עניין על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר14.הערה: בניסוי זה, שני sgRNAs נועדו לכוון א?…

Representative Results

אין ויוו אנליזה פונקציונלית, זה קריטי כדי לזהות את התאים שלתוכו הוכנסו אקסוגני gene (s). בעוד הביטוי של סמן, כגון ה-GFP בתאים שאינם מתרבים יכול להיות כוללים את במשך תקופה ארוכה של זמן, האות ירד ברצף לתוך תאים מתרבים. המחשה של אפקט זה הוא הפגין באיור1. כדי לעק?…

Discussion

באמצעות אלקטרופורציה exo הרחם , בעבר דיווחנו מבוסס-siRNA ויוו פונקציונלי ניתוחים של Atoh1 בשלב מוקדם של גרגר אסטרוציטומה תא בידול8. הודות siRNA דילול/השפלה של חשיפה של עוברי מחוץ לחומה הרחם, ניתוח פנוטיפי של התאים גרגר electroporated היה מוגבל העובריים. עם זאת, השיטה הנוכחית איפשרה נ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מעריכים את לורה Sieber, אנה Neuerburg, יאסין הרים, פטרה Schroeter לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם ד”ר ק’ Reifenberg, ק’ Dell ועמ’ Prückl לקבלת סיוע מועיל עבור ניסויים בבעלי חיים-DKFZ; הדמיה הליבה במתקני את DKFZ ו קרל Zeiss במרכז DKFZ עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי פתוח, קה 4472/1-1 (כדי D.K.).

Materials

Alexa 488 Goat anti-Chicken ThermoFisher A11039 1:400 dilution
Alexa 568 Donkey anti-Mouse Life Technologies A-10037 1:400 dilution
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit ThermoFisher A21207 1:400 dilution
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit Life Technologies A31573 1:400 dilution
Alkaline Phosphatase (FastAP) ThermoFisher EF0654
Autoclave band Kisker Biotech 150262
BamHI (HF) NEB R3136S
BbsI (FastDigest) ThermoFisher FD1014
Cellulose Filter Paper (Whatman) Sigma-Aldrich WHA10347525
Cloth Tork 530378
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM800
D-Luciferin biovision 7903-1
DAPI Sigma-Aldrich D9542 1:1000 dilution
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) VWR 4566
DMEM Glutamax ThermoFisher 31966047
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
EcoRI (HF) NEB R3101S
Electro Square Porator BTX ECM830
Endofree Maxi Kit Qiagen 12362
Ethanol Merck 107017
Eye ointment (Bepanthen) Bayer 81552983
Fast Green Merck 104022
FBS ThermoFisher 10270-016
Filter (0.22 µm) Merck F8148
Fluorescent cell imager (ZOE) Biorad 1450031
Forceps straight Fine Science Tools 91150-20
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) Fisher Scientific 15387311
GFP antibody Abcam ab13970 1:1000 dilution
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass Capillary with Filament Narishige GD1-2
Heating Pad ThermoLux 463265 / -67
Image Processing software (ImageJ and Fiji) NIH
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) Carl Roth AKP0.1
Isoflurane Zoetis TU061219
IVIS Lumina LT Series III Caliper Perkin Elmer CLS136331
Kalt Suture Needles Fine Science Tools 12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix Kapa Biosystems KK2601
Ki67 antibody Abcam ab15580 1:500 dilution
Light Pointer Photonic PL3000
Liquid blocker pen Kisker Biotech MKP-1
Metamizol WDT
Microgrinder Narishige EG-45
Microinjector Narishige IM300
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Microscope software ZEN Zeiss
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) Fine Science Tools 18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek) VWR 4583
p27 antibody BD bioscience 610241 1:200 dilution
Paraformaldehyde Roth 335.3
PBS (1x) Life Technologies 14190169
pCAG-EGxxFP Addgene 50716
Polyethylenimine Sigma-Aldrich 408727
pX330 plasmid Addgene 42230
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Quick Ligation Kit NEB M2200S
Ring Forceps Fine Science Tools 11103-09
Slides (SuperFrost) ThermoFisher 10417002
Software for biostatistics (Prism 7) GraphPad Software, Inc
Spitacid EcoLab 3003840
Stereomicroscope Nikon C-PS
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
Surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical scissors with blunt tip Fine Science Tools 14072-10
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) SMI 220340
T4 DNA Ligation Buffer NEB B0202S
T4 PNK NEB M0201S
Tissue scissors Blunt (11.5 cm) Fine Science Tools 14072-10
TOP2B antibody Santa Cruz sc13059 1:200 dilution
Trypsin (2.5 %) ThermoFisher 15090046
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum Xceltis GmbH CUY650P5
Vaporizer Drägerwerk AG GS186

References

  1. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  2. Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
  3. Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
  4. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  5. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
  6. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
  7. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
  8. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
  9. Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
  10. Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
  11. Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
  12. Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
  13. Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  14. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  16. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
  18. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
  19. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
  20. Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).

Play Video

Cite This Article
Feng, W., Herbst, L., Lichter, P., Pfister, S. M., Liu, H., Kawauchi, D. CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer. J. Vis. Exp. (136), e57311, doi:10.3791/57311 (2018).

View Video