Summary

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Published: June 09, 2018
doi:

Summary

Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.

Abstract

Fehlbildung des Gehirns wird oft durch genetische Mutationen verursacht. Entschlüsselung der Mutationen bei Patienten gewonnenem Gewebe hat mögliche ursächliche Faktoren der Krankheiten identifiziert. Um den Beitrag der eine Dysfunktion der mutierten Gene zur Krankheitsentwicklung zu validieren, ist die Generation von Tiermodellen, die Mutationen tragen ein offensichtlicher Ansatz. Während Keimbahn gentechnisch Mausmodellen (GEMMs) sind beliebte biologische Hilfsmittel und reproduzierbare Ergebnisse aufweisen, ist beschränkt durch die Zeit und Kosten. Unterdessen können nicht Keimbahn GEMMs oft erkunden Genfunktion in praktikabler Weise. Da einige Gehirn Krankheiten (z.B. Hirntumoren) scheinen aus somatischen ergeben aber nicht Keimbahn-Mutationen, nicht Keimbahn chimärer Maus-Modellen, in der normale und abnormale Zellen nebeneinander bestehen, für die krankheitsrelevanten Analyse hilfreich sein könnte. In dieser Studie berichten wir über eine Methode zur Einarbeitung von CRISPR-vermittelte somatische Mutationen im Kleinhirn. Speziell, wir nutzten bedingte Knock-in Mäusen, in denen Cas9 und GFP chronisch durch die CAG (CMV Enhancer/Huhn ß-Actin) Projektträger nach Cre aktiviert sind-vermittelten Rekombination des Genoms. Selbst entworfene Single-Guide RNAs (SgRNAs) und die Cre-Rekombinase-Sequenz, beide in einer einzigen Plasmid-Konstruktion, kodiert wurden in zerebelläre Stamm/Vorläuferzellen im Anfangsstadium mit in Utero Elektroporation geliefert. Infolgedessen wurden transfizierten Zellen und ihre Tochterzellen mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP), und erleichtert so die phänotypische Analysen beschriftet. Daher ist diese Methode nicht nur Elektroporation-basierte gen Lieferung in zerebelläre Embryonalzellen zeigen aber auch vorschlagen einen neuartigen quantitativen Ansatz um CRISPR-vermittelten Verlustfunktion-Phänotypen zu beurteilen.

Introduction

Erkrankungen des Gehirns sind eines der schrecklichsten tödlichen Krankheiten. Sie resultieren oft aus genetischen Mutationen und anschließende Dysregulation. Zum Verständnis der molekularer Mechanismen von Erkrankungen des Gehirns haben immer anhaltende Anstrengungen zu entschlüsseln, die Genome von menschlichen Patienten eine Reihe von möglichen begründenden Genen entdeckt. Bisher wurden Keimbahn gentechnisch Tiermodellen in Vivo Gain-of-Function (GOF) und Verlustfunktion (LOF) Analysen von solchen Kandidatengenen genutzt. Durch die beschleunigte Entwicklung von funktionalen Validierungsstudien ist eine praktikable und flexible in Vivo gen Testsystem für das Studium der Genfunktion wünschenswert.

Die Anwendung einer in Vivo -Elektroporation-basierte gen-Transfer-System, das sich entwickelnde mausgehirn ist für diesen Zweck geeignet. In der Tat haben mehrere Studien in Utero Elektroporation mit ihr Potenzial durchzuführen Funktionsanalysen in die entwickelnde Gehirn1,2,3gezeigt. Tatsächlich haben mehrere Regionen des Gehirns Maus, z. B. die Großhirnrinde4Retina5, Zwischenhirn6, Hinterhirn7, Kleinhirn8und Rückenmark9 durch somatische Gentherapie Lieferung ins Visier genommen Ansätze, so weit.

In der Tat hat transiente Genexpression von in Vivo Elektroporation auf embryonale mäusegehirnen lange für GOF-Analyse verwendet. Den letzten Transposon-basierte genomische Integrationstechnologien weiter aktiviert langfristige und/oder bedingte Expression von Genen Interesse10,11, was vorteilhaft in einer räumlichen und zeitlichen Weise während der Genfunktion sezieren ist Entwicklung. Im Gegensatz zu GOF Analyse wurde LOF Analyse schwieriger. Während die Transiente Transfektion von SiRNAs und ShRNA-tragenden Plasmide durchgeführt wurde, sind Langzeitwirkungen von LOF Gene nicht wegen eventuellen Abbau von exogen eingeführten Nukleinsäuren wie Plasmide und DsRNAs garantiert. Die CRISPR/Cas-Technologie bietet jedoch einen Durchbruch im LOF Analysen. Genen Codierung fluoreszierende Proteine (z. B.GFP) oder biolumineszenter Proteine (z.B.Firefly Luciferase) haben gemeinsam mit CRISPR-Cas9 und SgRNAs der Zellen, CRISPR-Cas9-vermittelte somatische Mutationen zu kennzeichnen transfiziert wurden. Trotzdem, dieser Ansatz hätte Einschränkungen in funktionelle Studien auf Proliferierende Zellen da exogene Markergene verdünnt und nach langfristigen Verbreitung abgebaut. Während die transfizierten Zellen und ihre Tochterzellen CRISPR-induzierte Mutationen in ihrem Genom unterziehen, können ihre Spuren im Laufe der Zeit verloren gehen. Genetische Kennzeichnung Ansätze wäre daher geeignet, um dieses Problem zu umgehen.

Vor kurzem haben wir eine LOF CRISPR-basierte Methode in zerebelläre Granulat-Zellen, die eine langfristige Verbreitung während ihrer Differenzierung12durchlaufen entwickelt. Um den transfizierten Zellen genetisch zu beschriften, wir ein Plasmid trägt eine SgRNA zusammen mit Cre gebaut und Cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Mäuse13 in Utero Elektroporation mit das Plasmid eingeführt. Im Gegensatz zu normalen Plasmid-Vektoren Codierung EGFP, dieser Ansatz erfolgreich mit der Bezeichnung transfizierten Granulat Neuron Vorstufen (festzulegenden) und ihre Tochterzellen. Diese Methode bietet großen Unterstützung in Vivo -Funktion von Genen des Interesses an proliferierenden Zellen im normalen Gehirnentwicklung und einem Tumor neigende Hintergrund zu verstehen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden nach Tierschutzbestimmungen durchgeführt und von den zuständigen Behörden genehmigt wurden (Regierungspräsidium Karlsruhe, Zulassungsnummern: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 und G133/14). 1. erzeugen Sie pU6-SgRNA-Cbh-Cre Plasmide Entwerfen Sie die SgRNA auf ein Gen von Interesse nach der zuvor veröffentlichten Protokoll Nr.14.Hinweis: In diesem Experiment sind zwei SgRNAs entwickelt, um die Maus Top2b gen und eine un…

Representative Results

Für in Vivo Funktionsanalyse ist es entscheidend, die Zellen zu identifizieren, in denen exogene-Gens eingeführt wurden. Während der Ausdruck eines Markers wie GFP in nicht wuchernden Zellen für einen langen Zeitraum hinweg, weiterverfolgt kann sein das Signal nacheinander in proliferierenden Zellen verirrt. Ein Beispiel für diesen Effekt ist in Abbildung 1gezeigt. Zur Umgehung den Fußabdruck von transfizierten Zellen in LOF Analysen zu verlier…

Discussion

Mit Exo Utero Elektroporation, haben wir bereits berichtet, dass SiRNA basierenden in Vivo Funktionsanalysen des Atoh1 in einem frühen Stadium der zerebelläre Granulat Zell-Differenzierung8. Durch SiRNA Verdünnung/Abbau und Exposition von Embryonen außerhalb der Gebärmutterwand beschränkte sich die phänotypische Analyse der elektroporiert Granulat Zellen auf embryonalen Phase. Jedoch aktiviert die aktuelle Methode Analyse des Phänotyps der postnatalen Tiere.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir schätzen Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim und Petra Schroeter für technische Hilfe. Wir danken auch DRS. K. Reifenberg, K. Dell und P. Prückl für hilfreiche Unterstützung für Tierversuche am DKFZ; die Imaging Core Facilities des DKFZ und Carl Zeiss Imaging Center im DKFZ für die Bildgebung der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (DK) unterstützt.

Materials

Alexa 488 Goat anti-Chicken ThermoFisher A11039 1:400 dilution
Alexa 568 Donkey anti-Mouse Life Technologies A-10037 1:400 dilution
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit ThermoFisher A21207 1:400 dilution
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit Life Technologies A31573 1:400 dilution
Alkaline Phosphatase (FastAP) ThermoFisher EF0654
Autoclave band Kisker Biotech 150262
BamHI (HF) NEB R3136S
BbsI (FastDigest) ThermoFisher FD1014
Cellulose Filter Paper (Whatman) Sigma-Aldrich WHA10347525
Cloth Tork 530378
Confocal laser scanning microscope Zeiss LSM800
D-Luciferin biovision 7903-1
DAPI Sigma-Aldrich D9542 1:1000 dilution
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) VWR 4566
DMEM Glutamax ThermoFisher 31966047
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
EcoRI (HF) NEB R3101S
Electro Square Porator BTX ECM830
Endofree Maxi Kit Qiagen 12362
Ethanol Merck 107017
Eye ointment (Bepanthen) Bayer 81552983
Fast Green Merck 104022
FBS ThermoFisher 10270-016
Filter (0.22 µm) Merck F8148
Fluorescent cell imager (ZOE) Biorad 1450031
Forceps straight Fine Science Tools 91150-20
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) Fisher Scientific 15387311
GFP antibody Abcam ab13970 1:1000 dilution
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass Capillary with Filament Narishige GD1-2
Heating Pad ThermoLux 463265 / -67
Image Processing software (ImageJ and Fiji) NIH
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) Carl Roth AKP0.1
Isoflurane Zoetis TU061219
IVIS Lumina LT Series III Caliper Perkin Elmer CLS136331
Kalt Suture Needles Fine Science Tools 12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix Kapa Biosystems KK2601
Ki67 antibody Abcam ab15580 1:500 dilution
Light Pointer Photonic PL3000
Liquid blocker pen Kisker Biotech MKP-1
Metamizol WDT
Microgrinder Narishige EG-45
Microinjector Narishige IM300
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Microscope software ZEN Zeiss
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) Fine Science Tools 18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek) VWR 4583
p27 antibody BD bioscience 610241 1:200 dilution
Paraformaldehyde Roth 335.3
PBS (1x) Life Technologies 14190169
pCAG-EGxxFP Addgene 50716
Polyethylenimine Sigma-Aldrich 408727
pX330 plasmid Addgene 42230
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Quick Ligation Kit NEB M2200S
Ring Forceps Fine Science Tools 11103-09
Slides (SuperFrost) ThermoFisher 10417002
Software for biostatistics (Prism 7) GraphPad Software, Inc
Spitacid EcoLab 3003840
Stereomicroscope Nikon C-PS
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
Surgical scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical scissors with blunt tip Fine Science Tools 14072-10
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) SMI 220340
T4 DNA Ligation Buffer NEB B0202S
T4 PNK NEB M0201S
Tissue scissors Blunt (11.5 cm) Fine Science Tools 14072-10
TOP2B antibody Santa Cruz sc13059 1:200 dilution
Trypsin (2.5 %) ThermoFisher 15090046
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum Xceltis GmbH CUY650P5
Vaporizer Drägerwerk AG GS186

References

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Feng, W., Herbst, L., Lichter, P., Pfister, S. M., Liu, H., Kawauchi, D. CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer. J. Vis. Exp. (136), e57311, doi:10.3791/57311 (2018).

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