Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format
Summary
Hier präsentieren wir eine Methode für eine menschliche in Vitro Modell der Stretch Verletzungen in einem 96-Well-Format auf einer Zeitskala für Trauma auswirken. Dazu gehören Methoden für die Herstellung von dehnbaren Platten, Quantifizierung der mechanischen Beleidigung, Kultivierung und verletzte Zellen, Bildgebung und hohe Inhaltsanalyse, Verletzungen zu quantifizieren.
Abstract
Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist eine klinische Herausforderung mit hoher Morbidität und Mortalität. Trotz jahrzehntelanger präklinische Forschung sind keine bewährten Therapien für TBI entwickelt worden. Dieses Papier stellt eine neuartige Methode zur präklinischen Neurotrauma Forschung vorhandenen präklinische Modellen ergänzen. Es stellt menschliche Pathophysiologie durch den Einsatz von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen (HiPSCNs). Es erreicht laden Puls Dauer ähnlich wie die Beladung Dauer der klinischen geschlossen Kopf Auswirkungen Verletzungen. Das Unternehmen beschäftigt eine 96-Well-Format, die erleichtert das Hochdurchsatz Experimenten und effiziente Nutzung von teuren Zellen und Kultur Reagenzien macht. Silikonmembranen sind zuerst behandelt, um neurotoxische ausgehärtete Polymer zu entfernen und dann verklebt kommerzielle 96-Well-Platte stellen, dehnbare 96-Well-Platten schaffen. Ein Custom-Built Gerät wird verwendet, um einige oder alle der gut Böden von unten, einrücken, induzieren äquibiaxial mechanische Belastung, der Zellen in der Kultur in den Vertiefungen mechanisch verletzt. Die Beziehung zwischen Eindringtiefe und mechanischer Belastung richtet sich empirisch mit high-Speed-Videografie gut Böden bei Einzug. Zellen, einschließlich HiPSCNs, können auf diese silikonmembranen mit modifizierten Versionen von konventionellen Zelle Kultur Protokolle kultiviert werden. Fluoreszierende mikroskopische Aufnahmen von Zellkulturen werden erworben und analysiert nach einer Verletzung in einem semi-automatischen Mode, die Höhe der Verletzung in jede Vertiefung zu quantifizieren. Das vorgestellte Modell ist optimiert für HiPSCNs aber könnte theoretisch auf andere Zelltypen angewendet werden.
Introduction
TBI ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in den Vereinigten Staaten verursacht rund 52.000 Todesfälle und 275.000 Krankenhausaufenthalte pro Jahr1. Mehr als 30 klinische Studien der Kandidat Therapeutika für TBI wurden ohne einen einzigen Erfolg2durchgeführt. Dieses einheitliche Versagen legt nahe, dass Mensch-spezifische Prozesse der Pathophysiologie beobachtet in gängigen vorklinischen Nager-Modelle menschlichen TBI trennen.
Das Aufkommen des HiPSCNs schuf Neurotrauma in einem menschlichen in-vitro- Modell zu lernen. Drogen-screening mit HiPSCN-basierte Modelle kann Ergebnisse liefern, die mehr vorausschauende klinischen Erfolg als Modelle Nagetiere Zellen beschäftigt sind. HiPSCNs können auch genetisch manipuliert werden, um zu isolieren und die Wirkung der einzelnen menschlichen genetischen Varianten auf Pathologie3studieren.
In diesem Manuskript beschriebene Methode soll die einzigartigen Vorteile der HiPSCN-basierte Krankheit Modellierung bis Neurotrauma bringen. In-vitro- Stretch Verletzungen Modelle von Neurotrauma sind gut etablierte4,5,6 mit primären Nagetier Zellen und menschlichen neuronalen Krebszelllinien. Die meisten dieser Modelle erzeugen Strecke durch pneumatisch laden eine Silikonmembran. Dieser Ansatz ist wirksam bei einer einzigen-well-Format aber schwierig, bis hin zu einem Multi-well-Format7bewährt. Infolgedessen gab es nie ein hohen Durchsatz-Bildschirm für Agenten, Stretch verletzte Neuronen zu behandeln.
In diesem Modell erstreckt sich die Membran durch Einrückung von unten mit einer starren Eindringkörper. Dieser Ansatz hat immer wieder gezeigt, klinisch relevante Pathologie in Vitro in einzelnen Brunnenanlagen8,9,10zu generieren. Unsere jüngsten Arbeit hat gezeigt, dass es leicht auf einem 96-Well-Format skaliert unter Beibehaltung Pulsdauern in der Größenordnung von zehn Millisekunden11, das ist die Zeit, die Domäne der Kopf Auswirkungen Veranstaltungen12,13geschlossen.
Zusammenfassend lässt sich sagen sind die wichtigsten Vorteile dieses Modells in-vitro- Verletzung der 96-Well-Format, die Verwendung von HiPSCNs und klinisch relevanten Zeitbereich der Beleidigung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Schlüssel zur Erlangung eines konsistenten, wendet Biofidelic Phänotyp in diesem Modell eine konsistente Biofidelic mechanische Beleidigung. Dieses Modell kann Puls Dauer so kurz wie 10-15 ms, generieren die Pulsdauern für menschliche Kopf Einflüsse nach cadaveric Experimente12,13ähneln. Die Konsistenz dieser Beleidigung richtet sich nach der Ausrichtung der Platte mit dem Eindringkörper Block und konsequente Schmierung der Eindringkörper. Wenn der Eindringkörper Block gut ausgerichtet ist, gibt es kein Trend in der angewandten Belastung in Zeilen oder Spalten (Abbildung 2). Eine dünne Schicht Gleitmittel erstellt in der Regel weniger Reibung als eine dicke Schicht und zähe Fette sind nicht empfohlen, da sie das Silikon foul und behindern den Durchgang des Lichtes während Mikroskopie. Die derzeitige Phase Verdrängung Amplitude kann wesentlich unterschreiten die zwangsverschiebung Amplitude wenn viele Eindringkörper verwendet werden, und die vorgeschriebenen Bühne Verdrängung Amplitude ist groß (> 3 mm). Jedoch während die tatsächliche Verschiebung kleiner als die zwangsverschiebung an große Amplituden ist, bleibt es wiederholbar (Abb. 2 b). Also, große, tatsächliche Verschiebungen Amplituden zuverlässig erhalten Sie durch einen vorgeschriebenen Wert über den gewünschten Wert eingeben. Verdrängung Amplitude zählt nur weil es einen leicht aufgezeichneten Proxy für die Peak-Membran-Sorte, die direkt die mechanische Beleidigung misst, die Pathologie induziert. Daher ist für die Bestimmung der Membran Belastung von Bühne Verschiebung beschriebene Verfahren entscheidend. Dieser Prozess sollte wiederholt werden, wenn alle wichtigen Änderungen an das System, das die Interaktion zwischen der Platte und der Eindringkörper, zum Beispiel, wenn verschiedene beeinflussen Durchmesser Eindringkörper, verschiedene Eindringkörper Materialien oder Beschichtungen oder verschiedene Arten von Silikon Talsohle Teller dienen. Der Prozess der Neuausrichtung des Eindringkörpers Blocks und Bestimmung der Nullstellung sollte zu Beginn jedes Experiment wiederholt werden. Eine schematische Darstellung der ausdehnende Vorrichtung ist in Abbildung 1dargestellt. CAD-Modelle benötigt, um das Gerät zu reproduzieren sind als zusätzliches Material zur Verfügung gestellt: “Verletzung Gerät – Vollversammlung – generische 3D. SCHRITT “; die zugehörige Stückliste zur Verfügung gestellt alsergänzenden Tabelle1: Custom gebaut Geräte – BOM.xlsx. Siehe auch ergänzende 2 96 gut Tischplatte _loader – Belegung Verdrahtung Diagram.xlsx, beschreibt die Verkabelung Anschlüsse, die verschiedenen Komponenten der Systeme zu verbinden. “Interconnector_circuit_board.dip” beschreibt eine Platine, die die Kabel miteinander verbindet.
Wenn das Gerät mit der Bühne in der Mitte des Bewegungsbereichs deaktiviert ist, wird die Bühne bewegen, nachdem die Stromversorgung unterbrochen ist, da es federbelastet ist. Wenn die Stromversorgung wiederhergestellt ist, erkennt die Feedback-Schleife einen großen Unterschied zwischen der letzten bekannten vorgeschriebenen Position und die aktuelle Position. Dadurch wird die Bühne plötzlich zu bewegen, um die Position war es in, wenn das Gerät ausgeschaltet wurde. Dieser plötzliche Bewegungen kann Fehler in der Ausgabe des Encoders, verursachen, so darauf geachtet werden, sollte um das Gerät zu deaktivieren, nur dann, wenn es in seiner unpowered Position an der Spitze des Bewegungsbereichs ruht.
Die Herstellung Klemme dient zur Platte Körper und Silikon unten in einer Art und Weise zusammenzubringen, die optimale Verklebung ermöglicht. Zu diesem Zweck gibt es drei wichtige Funktionen im Design präsentiert die zusätzliche Datei “Presse sterben – generische 3D. SCHRITT “. Erstens ist die Klemme Kennzeichenhalter Körper parallel zum Boden Silikon. Wenn dies richtig gebaut wird, erfordert es keine Anpassung nach der Ersteinrichtung. Zweitens bietet die Schicht aus Schaumstoff in die Klemme eine kleine Menge der Compliance unter der Platte vollständig starres System einen plötzlichen Anstieg von NULL Spannkraft auf unendliche Spannkraft theoretisch erleben würden, wenn die Klemme geschlossen wurde. Die Position der Querlatte und Schraube der Klemme sind verstellbar, so dass der Abstand zwischen den beiden Seiten der Schelle fein abgestimmt werden kann.
Alle Anstrengungen sollten zu einem hellen, weißen Hintergrund hinter dem Punkt gut unten während der Belastung Charakterisierung Experimente erfolgen. Je besser der Kontrast in diesen Bildern, desto leichter wird es, automatisieren Sie den Prozess zur Messung der Höhe und Breite des Punktes, der mühsam werden kann für einen menschlichen Operator eine große Experiment zu analysieren sein. Hochgeschwindigkeits-Videographie der Unterseite eines Brunnens in einer 96-Well-Platte stellt Herausforderungen, da die Wände des Brunnens tendenziell Schatten werfen. Die Verwendung einer Lichtkuppel oder axiale Streulicht, die entlang der Sichtlinie der Kamera beleuchten kann, ohne das Bild verdunkelt eliminiert Schatten oder spiegelnde Reflexionen, die mit einer herkömmlichen Lichtquelle entstehen würden. Die hellste verfügbare Lichtquelle sollte verwendet werden, da heller Beleuchtung Bilder mit einer kurzen Belichtungszeit erworben werden kann. Kurze Belichtungszeiten zu Bewegungsunschärfe minimieren. Aktualisieren der Leuchtdioden (LEDs) in der axialen Streulicht ermöglicht kürzere Belichtungszeiten bei High-Speed-video Akquisition. Die LEDs können durch Öffnen der axialen Streulicht, entfernen die Aktie LEDs aufgerüstet werden, Montage 4 high-Power LED arrays in den hinteren Bereich mit LEDs Inhaber, Anschluss an eine Konstante Stromversorgung und Zusammenbau der axialen Streulicht (siehe Tabelle des Materialien für Katalog-Nummern). Der Nachteil der Modernisierung der LEDs ist, dass die passiv gekühlten LEDs für mehr als ein paar Sekunden durch die Gefahr der Überhitzung eingehalten werden können. Daher ist ein anderes Licht für die Ausrichtung der Post-Block und Kamera Anpassung erforderlich.
Die vorgestellte Methode zur Quantifizierung der Membran Belastung durch die Messung der Ausdehnung eines Punktes auf der Membran gestempelt ist relativ grob, aber können für mehrere Bohrlöcher in einer robusten Weise skalieren. Stamm-Bereich gut unten kann etwas ausführlicher mit digitaler Bildkorrelation charakterisiert werden. Diese Technik beinhaltet die gesprenkelten Strahlbild auf den Sockel des Brunnens und dann imaging bei High-Speed-während der Verformung. Kommerzieller Software lässt dann Stamm an jedem Punkt im Bild durch die Verfolgung der Entwicklung des gesprenkelten Musters zu quantifizieren.
Dieses Protokoll stellt einen facettenreiche, klinisch relevante, Stretch Verletzungen Phänotyp in HiPSCNs. Zelltod, Neurit Degeneration und Neurit Sicken sind alle gut dokumentierte Folgeerscheinungen von TBI bei Menschen und Tiermodelle15. Der Schlüssel zum Erfolg in diesem Modell ist zur Gründung und Aufrechterhaltung gesunde Kulturen. Im Allgemeinen ist ein Zelle Kultur Protokoll mit herkömmlichen starren Platten entwickelt eine lohnende Ausgangspunkt für dehnbare Platte Kultur. Allerdings muss immer die Möglichkeit, dass die fraglichen Zellen anders auf Silikon reagiert ggf. berücksichtigt werden. Dies gilt insbesondere für HiPSCNs, die sehr empfindlich auf Kulturbedingungen sind. Einige Beispiele für die Optimierung der Zellkonzentration Dichte und Laminin werden im Abschnitt Vertreter Ergebnisse (Abbildung 3, Abbildung 4) geliefert. Aktivierung des Silikons mit Plasmabehandlung ist von entscheidender Bedeutung. Silikon ist hydrophob und Plattierung; in seinem natürlichen Zustand wird es nicht an Laminin oder anderen Molekülen zur Förderung Zellhaftung binden. Plasmabehandlung rendert die Oberfläche hydrophil und reaktive Gruppen macht. Diese Änderungen ermöglichen Adhäsionsmoleküle an das Silikon zu binden und zu fördern Zellhaftung. Es ist wichtig zu beachten, dass die Wirkung der Plasma-Behandlung innerhalb von Minuten zerstreut, es sei denn, die Oberfläche in Flüssigkeit eingetaucht ist, und so Verfahren, bei denen die aktivierte Oberfläche Trocknen so schnell wie möglich durchgeführt werden sollte. Eine einfache Möglichkeit zu prüfen, ob die Wirkung der Plasmabehandlung abgeklungen ist ist ein Tröpfchen des Wassers auf der Oberfläche zu platzieren. Auf unbehandelten Silikon wird das Droplet, Perle, während auf Plasma behandelt Silikon, es verteilt wird. Mit der HiPSCNs, die wir verwendet (siehe Tabelle der Materialien), der Hersteller empfiehlt die Laminin mit der Zellsuspension als Pre-Beschichtung hinzufügen. Dieses Protokoll wurde dieser Ansatz erfolgreich integriert. Zwar die Segmentierung in der Theorie mit open-Source-Software oder allgemeine Programmiersprachen, erreicht werden kann, ist ein hohes Maß an Kompetenz mit diesen Tools erforderlich, um gute Ergebnisse zu erzielen. Neuriten sind häufig schwer zu Hintergrundsignal unterscheiden, weil sie so schlank sind. Wir empfehlen daher, die Nutzung der kommerziellen Software-Tools, die von hohen Inhalt Mikroskopie Unternehmen mit speziellen Modulen zur Segmentierung und Quantifizierung von Neuronen, verteilt, wenn sie verfügbar sind. Auch mit kommerzieller Software ist es ratsam, Exportieren von Bildern der Segmentierung, visuell Richtigkeit zu überprüfen.
Es gibt einige Einschränkungen, die verbunden sind mit der Arbeit in dehnbare Platten im Vergleich mit konventionellen, starren Platten zu arbeiten. Dehnbare Platten können wie gewohnt mit Luft Ziele abgebildet werden. Bildgebung mit Immersion Ziele ist jedoch sehr schwierig. Objektiv-Öl kann das Silikon beschädigen. Darüber hinaus übt das Ziel Druck auf die Silikonmembran, wie es nach oben bewegt. Dieser Druck verdrängt die Membran vertikal, macht es schwierig, die Probe in den Mittelpunkt zu rücken. Die silikonmembranen derzeit verwendet in der Herstellung der Platten sind etwa 250 µm dick. Diese Dicke überschreitet die Brennweite der vielen high-Power, Eintauchen Ziele. Besondere Sorgfalt müssen die Membranen lag perfekt flach vor spannen um die Ebenheit erforderlich für die Mikroskopie zu erreichen. Autofokus-Systeme können Abweichungen in der Ebenheit der fertigen Platte zu einem gewissen Grad ausgleichen. Zukünftige Versionen des Protokolls können die Membran vor Spannung, bevor es an die Platte oben nach Ebenheit gewährleistet gebunden ist. Das Klebstoff-freie Verfahren für die Verklebung der Silikonmembran, die Platte oben14 gilt als eine wichtige Stärke des aktuellen Protokolls. Es eliminiert das Risiko von Neurotoxizität von den Kleber als auch Abweichungen in Ebenheit durch ungleichmäßige Dicke der Klebstoffschicht.
Multi-Elektroden werden häufig in Experimenten mit HiPSCNs verwendet, um ihre Reife und Funktionalität zu bewerten. Leider sind diese Systeme nicht kompatibel mit diesem Modell, denn die Zelle anzuchtsubstrat starr. Es ist möglich eine dehnbare Multi-Elektroden-Array zu erstellen, obwohl dies bisher nur in einem einzigen gut nachgewiesen format16,17. Beachten Sie, dass Eindringkörper einzeln aus dem Eindringkörper Block entfernt werden können, so dass einige Brunnen nicht eingerückt sind und als Shams dienen können. Entfernen des Eindringkörpers Einzug verhindert aber nicht vollständig beseitigen, mechanische laden, da gibt es noch träge Bewegung der Flüssigkeit in den Vertiefungen, während die Bühne bewegt. Es lohnt sich vergleichen diese Brunnen, Brunnen in Platten, die nie Gegenstand Bühne Bewegung um einen pathologischen Einfluss der flüssigen Bewegung zu messen waren. Das Array der Eindringkörper im Block sollten auch Bisymmetric (symmetrische von vorne nach hinten und seitlich). Diese Vorsichtsmaßnahme wird sichergestellt, dass die Platte gleichmäßig während der Einrückung, geladen wird, so dass die Bühne nicht zur Seite kippen und verursachen die Stäbe in der Lagerung zu binden.
Eines der primären Herausforderungen zu therapeutischen Innovationen in Neurotrauma ist die Komplexität und Heterogenität der Erkrankung. Trauma gilt gleichzeitig multi-modale Stress für jeden Zelltyp in das zentrale Nervensystem. Neuronen zuverlässig aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) generiert worden und sind jetzt weit verbreitet von kommerziellen Anbietern. Innovation in diesem Bereich schnell verläuft, und anderen neuronalen Zelltypen wie Astrozyten18 und Mikroglia19 stammen auch von HiPSCs. Es können möglicherweise bald die Zelle-autonomen Antworten jedes dieser Zelltypen Trauma in Vitro und dann kokultur verschiedene Zelltypen zu verstehen, wie sie kommunizieren nach dem Trauma zu isolieren. Auf diese Weise kann es letztlich möglich, die klinische Herausforderung von unten, neu erstellen, um es gründlich in einem menschlichen System zu verstehen sein. Dieser Ansatz unterscheidet sich von den herkömmlichen Ansatz unter Berufung auf Nager-Modelle und hat das Potenzial, neue Erkenntnisse zu generieren, die zu den ersten Therapien für diese gemeinsame, verheerende und hartnäckigen Erkrankung führen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird teilweise durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R21NS098129) unterstützt. Wir würden gerne bestätigen hervorragende technische Unterstützung von SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng und Feng Yuan Bu, der entwarf und baute eine Struktur zur Unterstützung der Lichter bei high-Speed bildgebenden Experimenten in dieser Handschrift beschrieben verwendet .
Materials
| .010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
| Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
| Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
| Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
| High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
| LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
| LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
| FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
| 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
| servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
| Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
| cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
| digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
| data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International | ||
References
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