Метод для высокой скорости стретч травмы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нейронов в формате 96-луночных
Summary
Здесь мы представляем метод для модели человека в vitro стретч травмы в формате 96-луночных на шкале отношение к воздействия травмы. Это включает методы для изготовления растягивающийся плиты, количественное определение механических оскорбление, культивирования и ранив клетки, изображений и высокой контент-анализа для количественного определения травмы.
Abstract
Черепно-мозговой травмы (ЧМТ) является одной из основных клинических задач с высокой заболеваемости и смертности. Несмотря на десятилетия доклинических исследований были разработаны не проверенная терапия для TBI. Этот документ представляет новый метод для исследований доклинических нейротравма, предназначенные для дополнения существующих доклинических моделей. Он вводит человека патофизиологии с помощью человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, нейронов (hiPSCNs). Он достигает загрузки импульса продолжительность похож на длительность загрузки клинических закрытой травмы удара головой. Он использует формат 96-луночных, который способствует высокой пропускной способности эксперименты и обеспечивает эффективное использование дорогих клеток и культуры реагентов. Силиконовые мембраны сначала обработаны удалить нейротоксическое неотвержденных полимера и затем кабалу коммерческих 96-луночных пластине органов для создания эластичного 96-луночных пластины. Заказного устройства используется для отступа все или некоторые из хорошо дно из-под, вызывая equibiaxial механические штамм, который механически повреждает клетки в культуре в скважинах. Отношения между отступ глубины и механические деформации определяется эмпирически при высокой скорости видеосъемка хорошо днища отступа. На эти силиконовые мембраны с использованием модифицированных версий протоколы культуры клетки обычных можно культивируемых клеток, включая hiPSCNs. Флуоресцентный микроскопических изображений клеточных культур приобретаются и проанализированы после травмы в полуавтоматических моды для количественного определения уровня травмы в каждой скважине. Представленная модель оптимизирована для hiPSCNs, но в теории может применяться для других типов клеток.
Introduction
TBI является одной из основных причин смертности и заболеваемости в Соединенных Штатах, вызывая около 52 000 смертей и 275 000 госпитализаций каждый год1. Без единого успех2было проведено более 30 клинические испытания терапии кандидата для TBI. Эта форма неудача свидетельствует о том, что человека конкретных процессов отдельных человека TBI от патофизиологии, наблюдается в часто используемые доклинических моделях грызунов.
Появление hiPSCNs создала возможность для изучения нейротравма в модели человека в пробирке . Наркотиков, выявление с помощью модели, основанные на hiPSCN может доставить результаты, которые являются более интеллектуальный клинический успех, чем модели, используя грызунов клетки. Кроме того hiPSCNs может быть генетически манипулировать изолировать и изучить влияние индивидуальных человеческих генетических вариантов на патологии3.
Метод, описанный в этой рукописи призвана обеспечить уникальные преимущества на основе hiPSCN болезни, моделирования нейротравма. В vitro стретч травмы модели нейротравма, хорошо установленных4,5,6 с первичных клеток грызунов и человеческие нервные рак клеточных линий. Большинство из этих моделей генерировать стрейч загружая пневматически силиконовые мембраны. Этот подход является эффективным в едином формате хорошо но оказалось трудно масштаба до нескольких хорошо формате7. В результате никогда не было на экране высокой пропускной способности для агентов для лечения растяжения потерпевшего нейронов.
В этой модели мембраны тянется из-за отступ от под с жесткой индентора. Этот подход показал многократно для создания клинически значимых патологии в пробирке в одном хорошо систем8,9,10. Наши последние работы показал, что он легко масштабируется 96-луночных формат при сохранении импульса длительностью порядка десятков миллисекунд11, который является время, домен закрыт удара головы события12,13.
В целом основные преимущества этой модели в vitro травмы являются 96-луночных формат, использование hiPSCNs и клинически значимых времени домен оскорбление.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ключ для получения последовательной, biofidelic фенотип в этой модели является применение последовательного biofidelic механические оскорбление. Эта модель может генерировать импульса как 10-15 мс, которые похожи на длительности импульса для головы воздействия человека согласно трупной эксперименты12,13короткой длительности. Согласованности это оскорбление зависит от выравнивания пластины с блоком индентора и последовательной смазка бойки. Когда блок индентора хорошо скоординированы, существует не тенденция в прикладной напрягаться по строкам или столбцам (рис. 2 c). Тонкий слой смазки обычно создает меньше трения, чем толстый слой, и вязкой смазки не рекомендуется, потому что они фол силикона и воспрепятствовать проходу света при микроскопии. Фактические стадии Амплитуда перемещения может существенно отвечают предписанные перемещения амплитуды когда используются многие бойки, и амплитуда перемещения установленных стадии большие (> 3 мм). Однако фактическое перемещение меньше, чем установленный перемещения на большие амплитуды, он по-прежнему повторяемые (рис. 2B). Таким образом большие, фактического перемещения амплитуд надежно достигается путем ввода предписанные значения превышает требуемое значение. Амплитуда перемещения вопросы только потому, что это легко записи прокси для пик мембраны штамм, который непосредственно измеряет механических оскорбление, которое вызывает патологии. Таким образом процедура, описанная для определения деформации мембраны от стадии перемещения имеет решающее значение. Этот процесс должен повторяться, если какие-либо крупные изменения к системе, которая влияет на взаимодействие между пластиной и бойки, например если разные диаметр бойки, различные индентора материалов, покрытий или различные типы силикона дном плиты используются. Процесс реорганизации блок индентора и определении нулевой позиции следует повторить в начале каждого эксперимента. Схематическое изображение растяжения устройства показано на рисунке 1. CAD-модели, необходимые для воспроизведения устройство предоставляются дополнительные материалы: «повреждения устройства – полное собрание – универсальный 3D. ШАГ ‘; связанные Билл материалов, предоставленных какДополнительная таблица 1: Пользовательские построен устройства – BOM.xlsx. Также увидите Дополнительные таблицы 2 96 хорошо плиты _loader – Цоколевка проводки Diagram.xlsx, который описывает кабельных соединений, которые соединяют различные компоненты систем. «Interconnector_circuit_board.dip» описывает плат, соединяющего кабели.
Если устройство отключается с этапа в середине его путешествия, этап будет двигаться после отрезали власть, потому что это подпружиненный. Когда восстанавливается питание, петля обратной связи обнаружит большой разницы между последней известной позиции предписанные и фактическое положение. Это вызовет на сцену, чтобы переместить внезапно на позицию она находилась на момент отключения устройства. Это резкое движение может привести к ошибкам в выходных данных кодировщика, поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы отключить устройство, только тогда, когда в его неподключенных он покоится позицию в верхней части своей поездки.
Изготовление зажим предназначен для объединить тело и силиконовые нижней пластины в манере, которая позволяет оптимальную связь. С этой целью, есть три ключевые особенности в конструкции, представленные в дополнительном файле ‘ пресс умереть – универсальный 3D. ШАГ». Во-первых держатель тела зажим пластины параллельно нижней силикона. Если это правильно построен, это потребует без перестройки после первоначальной установки. Во-вторых слой поролона в зажим обеспечивает небольшое количество соответствия под плитой, как полностью жесткая система теоретически будет испытывать внезапное увеличение от нуля зажима для бесконечной зажима, когда зажим был закрыт. Положение перекладину и винт зажима регулируются таким образом, чтобы расстояние между двумя сторонами зажим может быть доработаны.
Следует приложить все усилия к тому, предоставлять яркий, белый фон позади точки на дне хорошо во время деформации характеристику экспериментов. Чем лучше контраст в эти образы, тем легче будет для автоматизации процесса измерения высоты и ширины точки, которая может стать утомительным для человека-оператора анализируя большой эксперимент. Высокоскоростной видеосъемка в нижней части скважины в плиту 96-луночных представляет проблемы, потому что стены также, как правило, отбрасывания теней. Использование купол света или осевой рассеянного света, который может осветить вдоль линии визирования камеры без затемнения изображения устраняет теней или зеркального отражения, которые возникнут с обычным источником света. Ярких доступен источник света должны использоваться потому что яркого освещения позволяет изображения, которые должны быть приобретены с короткое время экспозиции. Коротких продолжительностей свести к минимуму размытие движения. Обновление светоизлучающие диоды (СИД) в осевой рассеянный свет позволяет короче время экспозиции в высокоскоростной видео приобретения. Светодиоды можно обновить, открыв рассеянный свет осевой, удаление запасов светодиоды, монтаж 4 высокая мощность Светодиодных массивов на задней панели с использованием светодиодов держатели, подключив их к постоянного тока питания и сборкой рассеянный свет осевые (см. таблицу Материалы для каталога чисел). Недостатком обновление светодиодов является, что пассивно охлаждения светодиодов не могут храниться на более чем на несколько секунд из-за риска перегрева. Таким образом различные свет необходим для выравнивания после блока и камеры перестройки.
Представленный метод количественного определения деформации мембраны путем измерения дилатация точка штамп на мембраны относительно сырой, но он может масштабироваться до нескольких скважин на надежной основе. Поле деформации через дно хорошо можно охарактеризовать более подробно, с использованием цифровых изображений корреляции. Этот метод предполагает распыления пятнистым узором на базе скважины и затем изображений на высокоскоростной во время деформации. Коммерческое программное обеспечение может затем использоваться для количественного определения деформации в каждой точке изображения путем отслеживания эволюции крапинами узора.
Этот протокол создает многогранный, клинически значимых, стретч травмы фенотип в hiPSCNs. Гибель клеток, neurite дегенерация и neurite бисером являются все документально следы TBI в организме человека и животных моделей15. Ключ к успеху в этой модели установление и поддержание здоровой культуры. Вообще говоря протокол культуры клеток, разработанный с обычными жесткими пластинами является стоит отправной точкой для эластичного плиты культуры. Однако возможность, что в вопросе клетки могут по-разному реагируют на силиконовой всегда должны быть рассмотрены. Это особенно верно в отношении hiPSCNs, которые очень чувствительны к условиям культуры. Некоторые примеры оптимизации плотности и Ламинин концентрации клеток поставляются в разделе Представитель результаты (рис. 3, рис. 4). Активация силикона с плазменной обработки является жизненно важным. Силиконовый гидрофобный и инертной; в своем естественном состоянии он не будет привязан к Ламинин или других молекул, используемых для содействия клеток вложение. Плазменная обработка оказывает поверхности гидрофильных и предоставляет реактивной групп. Эти изменения позволяют молекул адгезии для привязки к силикона и поощрение вложения клеток. Важно отметить, что эффект лечения плазмы рассеивается в течение нескольких минут, пока поверхность погружен в жидкость, и поэтому процедуры, которые включают сушки поверхности активированного должно выполняться как можно быстрее. Простой способ проверить, если эффект от лечения плазмы стерлась является место капли воды на поверхности. На необработанных силикона капли будет шарик вверх в то время как на силиконовой плазмы лечить, он будет распространяться. С hiPSCNs, который мы использовали (см. Таблицу материалы), производитель рекомендует добавить Ламинин суспензию клеток, а не перед покрытием. Этот протокол включил этот подход успешно. Хотя сегментации в теории, можно с открытым исходным кодом или языки программирования общего назначения, для получения хороших результатов требуется высокая степень владения с помощью этих инструментов. Невритов часто трудно отличить от фонового сигнала, потому что они настолько тонкая. Поэтому мы рекомендуем использование средств коммерческого программного обеспечения, распространяемых высокое содержание микроскопии компаний с выделенных модулей для сегментации и количественной оценки нейронов, если они доступны. Даже с коммерческим программным обеспечением он мудр экспортировать изображения сегментации визуально проверить точность.
Существуют некоторые ограничения, связанные с работой в растягивающийся пластины, по сравнению с работы с обычными, жесткие пластины. Растягивающийся пластины может отражаться как обычно с воздушных целей. Однако очень трудно изображений с целями погружения. Объектив нефти может повредить силикона. Кроме того цель оказывает давление на силиконовые мембраны, как она движется вверх. Это давление вытесняет мембраны вертикально, что делает его трудно привести пример в фокус. Силиконовые мембраны, в настоящее время используется в изготовлении пластин, толщиной примерно 250 мкм. Эта толщина превышает Фокусное расстояние многих высокой мощности, погружение целей. Особое внимание необходимо заложить мембраны идеально плоской до зажима для достижения плоскостности, необходимые для микроскопии. Системы автофокусировка может компенсировать отклонения в плоскости готовые пластины в некоторой степени. Будущие версии протокола может предварительно напряжение мембраны, прежде чем он прикреплен к верхней пластине для обеспечения плоскостности. Процедуре свободных клей для склеивания силиконовые мембраны к верхней пластине14 считается важным преимуществом нынешнего протокола. Это устраняет риск нейротоксичность от клея, а также любые отклонения в плоскости из-за неоднородного Толщина клеевого слоя.
Несколькими электродами массивы обычно используются в экспериментах с hiPSCNs для оценки их зрелости и функциональность. К сожалению эти системы несовместимы с этой моделью, потому что субстрат культуры клеток является жестким. Это позволяет создать массив растягивающийся несколькими электродами, хотя это пока только было продемонстрировано в одном хорошо формате16,17. Обратите внимание, что бойки можно индивидуально удалены из блока индентора, так что некоторые скважины не отображаются с отступом и может служить Шамс. Удаление индентора предотвращает отступы, но не полностью устранить механические загрузки, так как есть еще инерционного движения жидкости в скважинах, во время этапа. Стоит сравнить эти скважины, скважины в плитах, которые никогда не подвергались этап движения для измерения любых патологических влияние движение жидкости. Кроме того массив бойки в блоке должны быть bisymmetric (симметричные спереди назад и стороны в сторону). Эта предосторожность гарантирует, что пластины равномерно загружается во время отступы, так что стадии не наклон вбок и вызвать стержней для связывания их подшипников.
Одна из главных задач для терапевтических инноваций в нейротравма является сложность и неоднородность состояния. Травма применяет мультимодальной стресс для каждого типа клеток в центральной нервной системе одновременно. Нейроны надежно образующиеся человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) и в настоящее время широко доступны от коммерческих поставщиков. Инновация идет быстро в этой области, и другие типы нервных клеток например астроциты18 и микроглии19 также вытекают из hiPSCs. Вскоре, возможно, можно изолировать клетки автономной ответы каждого из этих типов клеток травмы в пробирке и затем Сопредседатель культуры различных типов клеток чтобы понять, как они общаются после травмы. Таким образом она может быть в конечном итоге можно воссоздать клинической проблемой снизу вверх тщательно понять ее в систему человека. Этот подход отличается от традиционного подхода, опираясь на грызунов модели и имеет потенциал, чтобы генерировать новые идеи, которые приводят к первой терапии для этого состояния общих, разрушительных и неразрешимыми.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается грант от национального института здравоохранения (R21NS098129). Мы хотели бы отметить отличную техническую помощь от Сьюзан Чэнь, Джонатан Тан, Кортни Кавано, нг Кай Ши и Фэн Юань Бу, который спроектирован и построен структуры для поддержки огни, используемые во время высокой скорости обработки изображений эксперименты, описанные в этой рукописи .
Materials
| .010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
| Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
| Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
| Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
| High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
| LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
| LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
| FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
| 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
| servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
| Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
| cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
| digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
| data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International | ||
References
- Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. . Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).
- Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).
- Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).
- Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).
- Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).
- Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).
- Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).
- Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).
- Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).
- Kang, W. H., Morrison, B. Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).
- Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
- Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
- Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
- Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).
- Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).
- Yu, Z., Morrison, B. Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).
- Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
