JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Published: May 04, 2018
doi:
10.3791/57298
, , , , , , ,
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology,Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics,Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

أسباب الإصابة الزائفة الزّنجاريّة الاعتلال كبيرة في المضيفين الضعيفة. المكتبة متحولة الإدراج ينقول نونريدوندانت P. الزّنجاريّة سلالة PA14، عينت مجموعة PA14NR، يسهل تحليل وظيفة الجينات في عمليات عديدة. قدم هنا وضع بروتوكول لإنشاء نسخ عالية الجودة من المكتبة متحولة تعيين PA14NR.

Abstract

الزائفة الزّنجاريّة بكتيريا سلبية الغرام متنوعة وقابلة للتكيف فينوتيبيكالي وجينوتيبيكالي في كل مكان في البيئات البشرية. P. الزّنجاريّة قادرة على تشكيل الأغشية الحيوية وتطوير المقاومة للمضادات الحيوية وإنتاج عوامل الفوعة وتتطور سريعاً أثناء وجود عدوى مزمنة. وهكذا P. الزّنجاريّة يمكن أن يسبب الحادة والمزمنة، صعوبة في علاج الالتهابات، نتج عنه اعتلال كبير في قطاعات معينة من السكان المريض. هو سلالة P. الزّنجاريّة PA14 عزل سريرية بشرية مع بنية جينوم مصانة التي تصيب مجموعة متنوعة من المضيفين الثدييات ونونفيرتيبراتي مما يجعل PA14 عبئا جذابة لدراسة هذه العوامل الممرضة. في عام 2006، تم إنشاء مكتبة متحولة إدراج ينقول نونريدوندانت تحتوي على طفرات 5,459 المقابلة للجينات PA14 تنبأ 4,596. ومنذ ذلك الحين، وقد يسمح بتوزيع المكتبة PA14 مجتمع البحوث لتحسين فهم وظيفة الجينات الفردية ومسارات معقدة من P. الزّنجاريّة. ويتطلب الحفاظ على سلامة المكتبة من خلال عملية النسخ المتماثل تقنيات التعامل السليم والدقيق. تحقيقا لهذه الغاية، يعرض هذه المخطوطة البروتوكولات التي تصف بالتفصيل الخطوات التي تشارك في النسخ المتماثل مكتبة ومكتبة مراقبة الجودة والتخزين السليم لطفرات الفردية.

Introduction

الزائفة الزّنجاريّة بكتيريا سلبية الغرام متنوعة وقابلة للتكيف فينوتيبيكالي وجينوتيبيكالي موجودة في التربة، والمياه، وبيئات معظم البشرية، فضلا عن تبدل الجلد. مقارنة بالعديد من أنواع الجراثيم، وقد P. الزّنجاريّة جينوم كبيرة نسبيا من 5.5-7 Mbp مع ارتفاع G + C المحتوى (65-67%). وعلاوة على ذلك، نسبة كبيرة من الجينات، يشاركون في التكيف الأيضي وهي جزء من شبكات تنظيمية، مما يتيح مرونة كبيرة في الاستجابة للإجهاد البيئي1. P. الزّنجاريّة يعرب عدد كبير عوامل الفوعة ويسلك نزوع إلى نموذج الأغشية الحيوية، وتمتلك القدرة على تنسيق الاستجابة من خلال النصاب متعددة الاستشعار عن مسارات ويعرض قدرة ملحوظة على تطوير المقاومة للمضادات الحيوية والتسامح2،3،4،،من56،،من78. هذه السمات تحديات كبيرة لعلاج الالتهابات التي تسببها P. الزّنجاريّة.

المزمن يمكن أن تحدث التهابات P. الزّنجاريّة في العديد من الحالات المرضية. التليف الكيسي (CF)، أمراض وراثية الناجمة عن تحور الجين التليف الكيسي Transmembrane الموصلية منظم (CFTR) ، ينتج إفرازات يسهل أو المصابة داخل مجرى الهواء، والقصبات التدريجي، في نهاية المطاف، الموت من9من فشل في الجهاز التنفسي. قبل بلوغ سن الرشد، أغلبية المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي مصابون بأمراض مزمنة P. الزّنجاريّة، الذي يلعب دوراً رئيسيا في الإصابة بالأمراض والوفيات المرتبطة بهذا المرض10. بالإضافة إلى ذلك، المرضى الذين يعانون من حروق شديدة إصابات11، تراتشيوستوميس12، الاستبدالات المشتركة13أو نائحين القسطرة14 هم عرضه للإصابة P. الزّنجاريّة تتصل بقدرة هذه البكتيريا على شكل الأغشية الحيوية والهروب استضافة الردود الملتهبة15. علاوة على ذلك، يحدث الاستعمار دون منافسة بعد تحديد عدد سكان مقاومة للمضادات الحيوية متعددة أو التسامح من خلال العلاج مضادات الجراثيم واسعة الطيف، متسلسلة12،،من1617 , 18-تحسين فهم الآلية المرضية من P. الزّنجاريّة سيكون لها آثار هامة على العديد من الحالات المرضية.

وقد درست عدة P. الزّنجاريّة يعزل السريرية، بما في ذلك سلالات PAO1، PA103، PA14، وباك، على نطاق واسع للتحقيق ميزات مختلفة من P. الزّنجاريّة المرضية. من سلالة PA14 عزل سريرية التي ينتمي إلى واحدة من المجموعات الاستنساخ الأكثر شيوعاً في جميع أنحاء العالم19،20 ولا باساجيد على نطاق واسع في المختبر. PA14is ضراوة شديدة في نماذج الفقاريات من العدوى، مع الذيفان ملحوظة الشخصية21، بيلي هيكل22، جزر الإمراضية23، اكتب ثالثا إفراز نظام (TTSS)، سيتوتوكسيسيتي نحو الثدييات خلايا24 و التشكيلات الجانبية للمضادات الحيوية المقاومة واستمرار25. وعلاوة على ذلك، PA14 أيضا ضراوة شديدة في العديد من النظم النموذجية الممرض المضيف، بما في ذلك أوراق النبات نماذج تسلل26،27، نماذج الإصابةايليجانس كاينورهابديتيس 28، 29والحشرات نماذج31من30،، فضلا عن الالتهاب الرئوي الماوس نماذج32،33 وحرق الجلد نماذج34.

مكتبات المسخ على نطاق الجينوم هي مجموعات من اسوي طفرات في الجينات غير الأساسية التي تشكل أدوات قوية للغاية لفهم علم الأحياء لكائن حي بالسماح بتحليل وظيفة الجينات على نطاق الجينوم. اثنين ينقول قرب تشبع الإدراج متحولة المكتبات التي شيدت في P. الزّنجاريّة متاحة حاليا للتوزيع. مواقع الإدراج ترانسبوزونات وقد حددت لكل المكتبات. هذه المكتبات نونريدوندانت ما يسمى تيسير دراسات المجين على نطاق المنظومة من السلالات البكتيرية بتناقص إلى حد كبير في الوقت والتكاليف المتكبدة في الفحص أونتشاراكتيريزيد طفرات ينقول عشوائي. P. الزّنجاريّة PAO1 ينقول متحولة المكتبة، التي شيدت في MPAO1 عزل من سلالة PAO1 باستخدام ترانسبوزونات هوفوا/ها وهولاكز/ها35، هو تنسيق بمختبر مانويل، وجامعة واشنطن. المكتبة يتكون من مجموعة التحقق من تسلسل من طفرات ينقول 9,437 التي توفر تغطية واسعة الجينوم ويشمل اثنين من طفرات لمعظم الجينات36. تتوفر معلومات حول مكتبة متحولة ينقول PAO1 P. الزّنجاريّة في موقع المعمل مانويل الجمهور، ويمكن الوصول إليها عن طريق شبكة الإنترنت في http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. سلالة P. الزّنجاريّة PA14 ينقول نونريدوندانت الإدراج متحولة مكتبة (مجموعة PA14NR) التي شيدت في سلالة PA14 باستخدام ترانسبوزونات MAR2xT7 و Tnفوا37 توزع حاليا بقسم طب الأطفال مستشفى ماساشوستس العام. وتضم مجموعة من طفرات أكثر من 5,800 مع الملاحق ينقول واحدة في الجينات غير الضروريين37تعيين PA14NR. تفاصيل حول بناء مجموعة PA14NR موصوفة في http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB العامة، ويمكن الوصول إليها عن طريق شبكة الإنترنت في الموقع، الذي يحتوي أيضا على مجموعة متنوعة من أدوات البحث على الإنترنت لتيسير استخدام PA14NR تعيين.

وتتألف طفرات 5,459، مختارة من مكتبة شاملة لحوالي 34,000 ينقول عشوائي الإدراج طفرات، تتوافق مع جينات PA14 تنبأ 4,596 تمثل 77 في المائة من جميع الجينات PA14 توقع37مجموعة PA14NR الأصلي. أضيفت منذ بناء المكتبة في عام 2006 طفرات جديدة، وتعيين PA14NR ويشمل حاليا طفرات 5,800 أكثر من38 التي تمثل ما يقرب من جينات PA14 4,600. غالبية طفرات ينقول PA14 تم إنشاؤها في الخلفية نوع البرية37. تتوفر التفاصيل المتعلقة بكل عضو مكتبة متحولة، بما في ذلك الخلفية الوراثية، أما من خلال البحث في قاعدة البيانات على الإنترنت، أو عن طريق تحميل “مكتبة نونريدوندانت” جدول البيانات، كل الميزات المتوفرة على موقع PA14 (http:// pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi). غالبية طفرات تم إنشاؤها باستخدام في MAR2xT7 ينقول (MrT7)، مع مجموعة صغيرة تم إنشاؤها باستخدام ينقول تنفوا (فوا)37. وقد كل ينقول كاسيت مقاومة للمضادات الحيوية، مما يسمح للمسخ التحديد باستخدام الجنتاميسين (MrT7) أو كاناميسين (فوا). مجموعة PA14NR من طفرات المخزنة في لوحات 96-جيدا ثلاثة وستون، ويشمل اثنين التحكم 96-بئر إضافية تلقيح لوحات، والتي تتكون من نوع البرية PA14 وآبار أونينوكولاتيد أولمبية صيفية في نموذج سابق الإعداد. يسهل تنسيق لوحة 96-جيدا المقترنة مع أدوات البحث على شبكة الإنترنت إلى حد كبير تطوير مخصص لفحص الاختبارات التي تسمح للمستخدمين بسهولة تحديد الجينات المرتبطة بالمسخ تعمل. أدوات البحث على الإنترنت أيضا تسهيل البحث واختيار طفرات ذات الصلة إضافية المطلوبة لإجراء المزيد من الدراسات.

مكتبات متحولة ينقول PA14 و PAO1 موارد عالمية هامة جداً للمجتمع العلمي، وأنها تكمل بعضها البعض في التحقق من وظيفة الجينات غير معروف ومسارات لهذا الممرض الجرثومي. مصادفة، منذ تشييد المكتبات طفرة ينقول PAO1 و PA14، أظهر تحليل تسلسل الحمض النووي الجينوم الكامل للعديد من P. الزّنجاريّة يعزل أن PAO1 و PA14 تنتمي إلى سوبكلاديس رئيسية مختلفة من الزّنجاريّة ص ونساله7،39،،من4041. تم العثور على سبب السريرية P. الزّنجاريّة يعزل موزعة في جميع أنحاء نسأله، حقيقة أن PAO1 و PA14 ينتمون إلى مختلف P. الزّنجاريّة أفرقة فرعية يعزز قيمة المكتبتين الطفرة ينقول للمقارنة الدراسات.

منشورات تصف البناء وفحص مكتبات متحولة البكتيرية، بما في ذلك، P. الزّنجاريّة المكتبات3537،42، متوفرة بسهولة في الأدب. ومع ذلك، على حد علمنا، لا المنشورة بروتوكولات تصف إجراءات مفصلة والتقنيات المستخدمة للنسخ المتماثل، الصيانة، والتحقق من صحة من مكتبات متحولة البكتيرية متوفرة.

ويصف المنهجية المبينة في هذه النشرة مجموعة من البروتوكولات الثلاثة التي تسهل استخدام وصيانة لمجموعة PA14NR. البروتوكول الأول يصف النسخ المتماثل للمكتبة كما أوصى إلى المستلمين من مجموعة PA14NR. البروتوكول الثاني يتضمن المبادئ التوجيهية streaking والمتنامية، وتخزين طفرات الفردية وحدد استخدام مجموعة PA14NR. البروتوكول الثالث يصف تقنيات مراقبة الجودة، بما في ذلك [بكر] تضخيم أجزاء من طفرات ينقول وتسلسل اللاحقة لتأكيد هوية متحولة. هذه المجموعة من البروتوكولات يمكن تكييفها للنسخ المتماثل وصيانة المكتبات متحولة البكتيرية أو مجموعات أخرى أيضا. النسخ المتماثل لمكتبات متحولة البكتيرية أو مجموعات ينصح بدرجة عالية الحفاظ على سلامة “النسخة الرئيسية” (النسخة الأصلية الواردة). النسخ المتماثل من عدة نسخ من مجموعة PA14NR للاستخدامات المختبرية الروتينية يقلل من احتمال تلوث إينتيرويل للنسخة الرئيسية.

Protocol

تنبيه: تستخدم تدابير السلامة BSL-2 القياسية عند التعامل مع P. الزّنجاريّة، مسببات الأمراض بشرية. إذا كنت فرد المناعة أو أي حالة طبية أن الزيادات الخاصة بك أكثر عرضه للعدوى البكتيرية، أخذ الحيطة والحذر خاصة عند العمل مع ص الزّنجاريّة. استشارة مكتب السلامة الأحيائية في المؤسسة الخاص?…

Representative Results

تم تكرارها اثنا عشر نسخ جديدة من مجموعة PA14NR باستخدام البروتوكول الأول، وإجراء تقييم مراقبة الجودة للنسخ الجديدة التي تم إنشاؤها وأجريت باستخدام “البروتوكول الثالث”. PA14NR مجموعة لوحات متحولة جنبا إلى جنب مع “لوحات التحكم”، والذي يتألف من ن?…

Discussion

ف. الزّنجاريّة PA14NR يقع موردا قيماً للمجتمع العلمي. ووفقا dataset مارس 2017 من تحليلات كلاريفاتي قاعدة بيانات “مؤشرات العلوم الأساسية”، ليبيراتي et al. (2006) في المرتبة 37، الذي يصف تشييد مجموعة PA14NR، في أعلى من 1 ٪ من منشورات علم الأحياء المجهرية. باحث جوجل تقارير الاستشهادا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن أشكر ليزا فيلبوتس Treadwell MGH المكتبة الظاهرية لتوجيهاتها في البحث عن قاعدة البيانات. هذا العمل كان تدعمه مؤسسة التليف الكيسي (YONKER16G0 و HURLEY16G0) والمعاهد الوطنية للصحة نييد (بف و ADE: R01 A1095338).

Materials

Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels – CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016)
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. . Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. . . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Tags

Pseudomonas AeruginosaPA14NR SetTransposon Mutant LibraryReplicationQuality ControlContamination PreventionSterile TechniquesReplicator Pin SterilizationLB Agar PlatesFreezer Storage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image