JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Published: May 04, 2018
doi:
10.3791/57298
, , , , , , ,
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology,Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics,Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Pseudomonas aeruginosa enfeksiyon savunmasız konaklarda önemli morbidite neden olur. Nonredundant transposon ekleme mutant Kütüphane P. aeruginosa baskı PA14 PA14NR grubu olarak belirlenmiş, analiz çok sayıda süreçlerde gen işlevlerinin kolaylaştırır. Burada sunulan yüksek kaliteli PA14NR ayarla mutant kitaplığın kopyalarını oluşturmak üzere bir protokoldür.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa phenotypically ve genotypically farklı ve uyarlanabilir Ayagin Gram-negatif bakteri insan ortamlarda her yerde var. P. aeruginosa biyofilmler formu, antibiyotik direnci geliştirmek, virülans faktörleri üretmek ve hızla gelişmeye kronik bir enfeksiyon sırasında yapabiliyor. Böylece P. aeruginosa hem akut ve kronik, enfeksiyonları, tedavisi zor bazı hasta nüfus önemli morbidite sonuçlanan neden olabilir. P. aeruginosa yük PA14 çeşitli PA14 bu patojen çalışmak için çekici bir zorlanma yapma memeli ve nonvertebrate ana bilgisayarları bozar bir korunmuş genom yapısı ile bir insan klinik izole olduğunu. 2006 yılında 5,459 mutantlar 4,596 tahmin edilen PA14 genler için karşılık gelen içeren nonredundant transposon ekleme mutant bir kütüphane oluşturulmuştur. O zamandan beri PA14 Kütüphane dağılımı bireysel genlerin fonksiyonun ve P. aeruginosakarmaşık yollar daha iyi anlamak araştırma topluluğu izin verdi. Çoğaltma işlemi boyunca Kütüphane bütünlük bakımından uygun taşıma ve hassas teknikler gerektirir. Bu amaçla, bu el yazması ayrıntılı adımları Kütüphane çoğaltma, Kütüphane kalite kontrol ve bireysel mutant uygun depolama yer tarif iletişim kuralları sunar.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa phenotypically ve genotypically farklı ve uyarlanabilir Ayagin Gram-negatif bakteri toprak, su ve en insani ortamlar, hem hem içinde cilt mikrofloranın mevcut olduğunu. Birçok bakteri türü için karşılaştırıldığında, P. aeruginosa 5,5-7 Mbp (65-%67) yüksek G + C içerik ile nispeten büyük bir genom vardır. Ayrıca, onun genleri önemli bir bölümünü metabolik adaptasyon katılmaktadırlar ve çevresel stres1yanıt olarak büyük esneklik için izin düzenleyici ağların bir parçasıdır. P. aeruginosa virülans faktörleri bir bolluk ifade eder, meyil formu biyofilmler için sergiler, birden çok çekirdek yolları algılama aracılığıyla yanıt koordine yeteneği sahip ve antibiyotik direnci geliştirmek için önemli bir kapasite görüntüler ve hoşgörü2,3,4,5,6,7,8. Bu öznitelikler P. aeruginosatarafından neden olduğu enfeksiyonların tedavisinde önemli sorunlar mevcut.

Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlar çok sayıda hastalık durumlarında oluşabilir. Kistik fibroz (CF), Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) gen mutasyon genetik bir hastalığı inspissated, enfekte sekresyonun solunum yolu içinde sonuçları ilerici bronşiektazi ve sonuçta, ölüm solunum yetmezliği9. Yetişkinlik, CF ile hastaların çoğu kronik morbidite ve mortalite ile bu hastalık10ilişkili anahtar bir rol oynayan P. aeruginosa, bulaşmış. Ayrıca, hastalar şiddetli Yanık yaraları11, tracheostomies12, eklem replasmanları13ya da kalıcı kateter14 ile P. aeruginosa enfeksiyon bakteri yeteneği oluşturmak için ilgili etkilenir biyofilmler ve kaçış ana bilgisayar inflamatuar yanıt-e doğru15. Ayrıca, çoklu antibiyotik dirençli ya da hoşgörülü nüfus geniş spektrumlu, sıralı antimikrobiyal tedavi12,16,17 seçildikten sonra kolonizasyon rekabet olmadan oluşur , 18. P. aeruginosa patogenezinde daha iyi anlamak için çok sayıda hastalık durumlarında önemli etkileri olacak.

Suşların PAO1, PA103, PA14 ve PAK, dahil olmak üzere birkaç P. aeruginosa klinik yalıtır P. aeruginosa Patogenez farklı özelliklerini araştırmak için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Soy PA14 en yaygın klonal gruplar dünya çapında19,20 birine ait olan ve yoğun laboratuvarda pasajlı değil bir klinik izole olduğunu. PA14is enfeksiyon, dikkate değer bir endotoksin ile omurgalı modellerinde son derece öldürücü profil21, pili yapısı22, patojen Adaları23, III salgı sistemi (TTSS) yazın, sitotoksisite doğru memeli hücreleri24 ve antibiyotik direnci ve sebat25profillerinde. Ayrıca, PA14 da çok sayıda ana bilgisayar-patojen modeli sistemlerinde son derece öldürücü, bitki yaprak da dahil olmak üzere26,27infiltrasyon modelleri,Caenorhabditis elegans enfeksiyon modeller28, 29, böcek modelleri30,31, hem de fare pnömoni modelleri32,33 ve cilt yanık modelleri34.

Genom çapında mutant kitaplıkları isogenic mutant gen işlevi analizini genomik bir ölçekte izin vererek bir organizma biyolojisi anlamak için çok güçlü araçlar teşkil önemli olmayan genlerdeki koleksiyonlarıdır. İki doygunluk yakınındaki transposon ekleme mutant kitaplıkları P. aeruginosa içinde inşa şu anda dağıtım için kullanılabilir. Transpozonlar ekleme siteleri her iki kütüphane için tespit edilmiştir. Bu sözde nonredundant kütüphaneler genom genelinde Çalışmalar bakteri suşlarının zamanı önemli ölçüde azaltarak kolaylaştırmak ve söz konusu olursa maliyet tarama uncharacterized rasgele transposon mutantlar. MPAO1 içinde inşa P. aeruginosa PAO1 transposon mutant Kütüphane, izole Transpozonlar IS kullanarak strain PAO1phoA/ hah velacZolduğunu / hah35, küratörlüğünü Manoil lab tarafından Washington Üniversitesi. Kütüphane koleksiyonunun geniş genom kapsama alanı sağlar ve çoğu genler36için iki mutantlar içeren bir sıra doğrulanmış 9,437 transposon mutant oluşur. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant kitaplığı hakkında bilgi http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm, kamu, internet erişimli Manoil lab Web sitesinde mevcuttur. P. aeruginosa zorlanma Transpozonlar MAR2xT7 ve TnphoAkullanarak strain PA1437 yılında inşa nonredundant transposon ekleme mutant kitaplığı (PA14NR Set) şu anda Pediatri bölümü tarafından dağıtılan PA14 Hastane Massachusetts General. PA14NR ayarla tek transposon eklemeleri önemli olmayan genler37‘ den fazla 5,800 mutantlarla topluluğu oluşur. PA14NR ayarla inşaatı ile ilgili ayrıntılar da içeren çeşitli PA14NR kullanımını kolaylaştırmak için online arama araçları kamu, internet erişimli site http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB içinde açıklanan Ayarlayın.

Orijinal PA14NR ayarla 5,459 mutantlar, tüm tahmin edilen PA14 genler%3777 temsil eden 4,596 tahmin edilen PA14 genler için karşılık gelen yaklaşık 34.000 rasgele transposon ekleme mutantlar, kapsamlı kitaplığından seçilen oluşur. Kütüphane inşaatı 2006 yılında beri yeni mutantlar eklenmiş ve halen yaklaşık 4,600 PA14 genler temsil fazla 5,800 mutantlar38 PA14NR kümesi içerir. PA14 transposon mutantlar çoğunluğu vahşi türü arka plan37yılında üretildi. Detayları da dahil olmak üzere genetik arka plan, mutant kütüphanenin her üye ile ilgili çevrimiçi veritabanı arama yoluyla veya Nonredundant kütüphane elektronik tablo, her iki özellik (http:// PA14 Web sitesinde kullanılabilir indirme mevcuttur pa14.mgh.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Mutantlar çoğunluğu MAR2xT7 kullanılarak oluşturulan TnPhoA (phoA) transposon37kullanılarak oluşturulan küçük bir set ile (MrT7) transposon. Her transposon gentamisin (MrT7) veya sefaloridin (phoA) kullanarak mutant seçim için izin verir bir antibiyotik direnci kaset var. Mutantlar PA14NR kümesi 63 96-şey levha depolanır ve kaplamalar, vahşi türü PA14 oluşur aşısını iki ek 96-şey denetimi içerir ve az wells bir hazır ayar deseni ara. Çevrimiçi arama araçları ile büyük ölçüde eşleştirilmiş 96-şey plaka biçimi kolayca mutant fenotipleri ile ilişkili genlerin tanımlamak, kullanıcıların deneyleri eleme özel geliştirme kolaylaştırır. Çevrimiçi arama araçları da arama ve seçim daha fazla çalışmalar için gerekli ek ilgili mutantların kolaylaştırmak.

PA14 ve PAO1 transposon mutant kitaplıklar bilimsel toplum için çok önemli küresel kaynaklar ve onlar birbirlerini tamamlayıcı bilinmeyen genlerin fonksiyonun ve yollar bu bakteriyel patojenin doğrulanıyor. Tesadüfen, PAO1 ve PA14 transposon mutasyon kitaplıklar inşaat beri PAO1 ve PA14 P. aeruginosa farklı büyük subclades için ait tam-genom DNA sıralama analizi birçok P. aeruginosa yalıtır göstermiştir phylogeny7,39,40,41. Klinik P. aeruginosa izole ediyor çünkü bulundu phylogeny PAO1 ve PA14 için farklı P. aeruginosa ait aslında boyunca dağıtılmış alt gruplar iki transposon mutasyon kitaplıkları için karşılaştırmalı değerini artırır çalışmalar.

İnşaat açıklayan ve P. aeruginosa kitaplıkları35,de dahil olmak üzere, bakteri mutasyona uğramış kütüphanelerin eleme yayınlar37,42, literatürde hazır. Ancak, bizim bilgi en iyi şekilde açıklayan ayrıntılı yordamlar ve çoğaltma için kullanılan teknikler hiçbir yayımlanmış bakım ve bakteri mutasyona uğramış kütüphanelerin doğrulama kullanılabilir iletişim kurallarıdır.

Bu yayında sıraladı metodoloji, kullanımı kolaylaştıran üç iletişim kuralları kümesi ve bakım PA14NR kümesi açıklar. İlk protokol çoğaltma Kütüphane PA14NR ayarla alıcıları için önerilen biçimde açıklamaktadır. İkinci Protokolü çizgiler, büyüyen ve bireysel mutant PA14NR ayarla kullanarak tanımlanan depolamak için yönergeler içerir. Kalite kontrol teknikleri, transposon mutantlar parçalardan amplifikasyon PCR ve mutant kimliğini onaylamak için sonraki sıralama dahil olmak üzere üçüncü protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralları kümesi de çoğaltma ve diğer bakteri mutasyona uğramış kitaplıkları veya koleksiyonları bakım için adapte olabilir. Bakteri mutasyona uğramış kitaplıkları veya koleksiyonları çoğaltılması son derece “ana kopya” bütünlüğünü korumak için tavsiye edilir (orijinal kopya aldı). Çoğaltma kümesinin PA14NR rutin laboratuvar kullanım için birkaç kopya ana kopya interwell bulaşma olasılığını en aza indirir.

Protocol

Dikkat: Standart BSL-2 güvenlik önlemleri P. aeruginosa, insan bir patojen işlerken kullanır. İmmün bireysel veya bakteriyel enfeksiyona yatkınlık artar herhangi bir sağlık sorunu varsa, özel P. ile çalışırken dikkatli aeruginosa. Kurumunuzun Biyogüvenlik ofiste danışmak ve ile çalışmaya başlamadan önce doktorunuza onay almak PA14 NR ayarla veya bakteriyel patojenlerin mutant kitaplıkları. <img alt="Figure 1" class="xf…

Representative Results

On iki yeni kopyalarını PA14NR ayarla ben ve üretilen yeni kopya bir kalite kontrol değerlendirme protokolü III kullanılarak gerçekleştirilmiştir protokolünü kullanarak çoğaltılmış. PA14NR mutant plaka ile birlikte kontrol levha, vahşi türü PA14 oluşur aşılamaya ve hazır ayar deseni (şekil 4A) ara wells az, çoğaltılmış ayarla methology Protokolü ı. denetiminde açıkla…

Discussion

P. aeruginosa PA14NR ayarla bilimsel topluluk için değerli bir kaynaktır. Göre Şubat 2017 dataset Clarivate Analytics’in temel bilim göstergeler veritabanından, Liberati vd. (2006) PA14NR ayarla inşaatı açıklayan, 37, Mikrobiyoloji yayınlar üst % 1 sınıflanır. Google Akademik Liberati vd. , 600’den fazla alıntıları raporları aynı derecede-in Ağustos 2017 orijinal el yazması (2006). Kütüphanede P. aeruginosa patogenezinde temel m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Veritabanı arama Lisa Philpotts MGH Treadwell sanal kütüphane onun rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Kistik Fibrozis Vakfı (YONKER16G0 ve HURLEY16G0) ve NIH NIAID tarafından desteklenmiştir (BPH ve ADE: R01 A1095338).

Materials

Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels – CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016)
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. . Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. . . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Tags

Pseudomonas AeruginosaPA14NR SetTransposon Mutant LibraryReplicationQuality ControlContamination PreventionSterile TechniquesReplicator Pin SterilizationLB Agar PlatesFreezer Storage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image