Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable présente dans le sol, l’eau et environnements plus humaines, ainsi que la microflore de la peau. Par rapport à beaucoup d’espèces bactériennes, P. aeruginosa possède un génome relativement important de 5.5-7 Mbp avec G + C haute teneur (65-67 %). En outre, une proportion importante de ses gènes sont impliquée dans l’adaptabilité métabolique et font partie de réseaux de régulation, ce qui permet une grande flexibilité dans la réponse aux stress environnementaux¹. P. aeruginosa exprime une multitude de facteurs de virulence, montre la propension à forme biofilms, possède la capacité de coordonner les réponses à travers plusieurs quorum sensing voies et affiche une remarquable capacité de développer une résistance aux antibiotiques et tolérance^{2,3,4,5,6,7,8}. Ces attributs présentent des défis importants pour traiter les infections causées par P. aeruginosa.

Chronique infections à P. aeruginosa peuvent se produire dans de nombreux États de la maladie. Fibrose kystique (FK), une maladie génétique due à une mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , traduit par ailleurs, infectées de sécrétions dans les voies respiratoires, bronchiectasie progressive et, finalement, la mort d’une insuffisance respiratoire⁹. L’âge adulte, la majorité des patients fibro-kystiques est chroniquement infectée par P. aeruginosa, qui joue un rôle clé dans la morbidité et la mortalité associées à cette maladie¹⁰. En outre, les patients souffrant de graves brûlures blessures¹¹, tracheostomies¹², prothèses articulaires¹³ou de cathéters à demeure¹⁴ sont à risque d’infection à P. aeruginosa lié à la capacité de la bactérie de forme biofilms et évasion hôte réponses inflammatoires¹⁵. De plus, la colonisation se produit sans concurrence après sélection d’une population antibiotique multi résistante ou tolérante au traitement antimicrobien à large spectre, séquentielle,^{12,16,17 , 18}. meilleure compréhension de la pathogenèse de P. aeruginosa aura des implications importantes pour nombreux états pathologiques.

Plusieurs isolats cliniques de P. aeruginosa , y compris les souches PAO1, PA103, PA14 et PAK, ont été largement étudiées afin d’étudier les différentes fonctionnalités de la pathogénèse P. aeruginosa . Souche PA14 est un isolat clinique qui appartienne à l’une des plus courantes dans le monde entier^19,groupes clonaux²⁰ et n’a pas été largement repiquée en laboratoire. PA14is hautement virulent chez les vertébrés modèles d’infection, par une endotoxine notable profil²¹, pili structure²², pathogénicité des Iles²³, tapez système de sécrétion III (TTSS), cytotoxicité vers mammalian cells²⁴ et profils de résistance et persistance antibiotique²⁵. En outre, PA14 est également très virulente dans de nombreux systèmes de modèle hôte-pathogène, y compris des feuilles des plantes infiltration modèles^26,27,Caenorhabditis elegans infection modèles^{28, 29}, insecte modèles^30,31, ainsi que la pneumonie souris modèles^32,33 et brûlures modèles³⁴.

Génome mutants bibliothèques sont des collections de mutants isogéniques de gènes non essentiels qui constituent des outils très puissants pour comprendre la biologie de l’organisme en permettant l’analyse de la fonction des gènes à l’échelle génomique. Deux bibliothèques près de saturation transposon insertion mutant construits chez P. aeruginosa sont actuellement disponibles pour distribution. Les sites d’insertion des transposons ont été déterminées pour les deux bibliothèques. Ces dits bibliothèques non redondante facilitent les études de Génome-large de souches bactériennes en diminuant considérablement le temps et de coûts impliqués dans dépistage indéterminées mutants transposon aléatoire. La bibliothèque mutante de transposon PAO1 P. aeruginosa , construite dans le MPAO1 isoler de souche PAO1 utilisant les transposons ISphoA/ hah etlacZ/ hah³⁵, est organisée par le laboratoire Manoil, Université de Washington. La bibliothèque se compose d’une collection de vérifier à la séquence de 9 437 mutants transposon qui fournit une couverture large de génome et inclut deux mutants pour la plupart gènes³⁶. Informations sur la bibliothèque mutante de P. aeruginosa PAO1 transposon sont disponibles sur le site de lab Manoil public, accessible par internet à http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa souche PA14 transposon non redondante insertion bibliothèque mutante (valeur PA14NR) construit en souche PA14 utilisant les transposons MAR2xT7 et TnphoA³⁷ est actuellement distribué par le département de pédiatrie au Massachusetts General Hospital. Le PA14NR Set comprend une collection de plus de 5 800 mutants avec insertions de transposon unique dans des gènes non essentiels³⁷. Détails sur la construction de l’ensemble de la PA14NR sont décrits dans le site public, accessible par internet http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, qui contient également une variété d’outils de recherche en ligne pour faciliter l’utilisation de la PA14NR Ensemble.

L’original PA14NR Set comprend 5 459 mutants, choisis parmi une bibliothèque complète d’environ 34 000 transposon aléatoire mutants d’insertion, qui correspondent aux 4 596 gènes PA14 prédites, ce qui représente 77 % de toutes les prévisions PA14 gènes³⁷. Depuis la construction de la bibliothèque en 2006 les nouveaux mutants ont été ajoutés, et le PA14NR Set comprend actuellement plus de 5 800 mutants³⁸ qui représentent environ 4 600 PA14 gènes. La majorité des mutants transposon PA14 générée dans le type sauvage fond³⁷. Précisions relatives à chaque membre de la bibliothèque mutante, y compris les antécédents génétiques, sont disponibles par le biais de la recherche de la base de données en ligne ou en téléchargeant la feuille de calcul de bibliothèque non redondante, ces deux fonctionnalités disponibles sur le site de PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.CGI). La majorité des mutants ont été créée à l’aide de la MAR2xT7 (MrT7) transposon, avec un petit ensemble créé à l’aide du transposon de TnPhoA (phoA)³⁷. Chaque transposon a une cassette de résistance aux antibiotiques, ce qui permet la sélection de mutants à l’aide de gentamicine (MrT7) ou la kanamycine (phoA). L’ensemble PA14NR de mutants est stocké dans soixante-trois plaques à 96 puits et inclut un contrôle 96 puits supplémentaire deux plaques qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalaient dans un modèle prédéfini. Le format de la plaque à 96 puits couplé avec les outils de recherche en ligne grandement facilite le développement personnalisé de dosages qui permettent aux utilisateurs d’identifier facilement les gènes associés aux phénotypes mutants de dépistage. Les outils de recherche en ligne facilitent également la recherche et la sélection de mutants de pertinents supplémentaires requis pour poursuivre ses études.

Les bibliothèques de mutant de transposon PA14 et PAO1 sont très importantes ressources globales pour la communauté scientifique, et ils complètent mutuellement dans la validation de la fonction des gènes inconnus et les voies de cet bactérie pathogène. Par coïncidence, depuis la construction des bibliothèques de mutation du transposon PAO1 et PA14, analyse de séquençage d’ADN du génome complet de nombreux isolats de P. aeruginosa a montré que PAO1 et PA14 appartiennent à différents sous-clades principaux de la P. aeruginosa phylogénie^7,39,40,41. Parce que les isolats cliniques de P. aeruginosa se trouvent répartis tout au long de la phylogenèse, le fait que PAO1 et PA14 appartiennent à différents de P. aeruginosa sous-groupes accroît la valeur des deux bibliothèques transposon mutation pour comparative études.

Les publications décrivant la construction et de criblage des bibliothèques de mutant bactériennes, y compris les bibliothèques P. aeruginosa ^35,37,42, sont facilement disponibles dans la littérature. Cependant, au meilleur de notre connaissance, aucun protocoles publiés décrivant les modalités et les techniques utilisées pour la réplication, entretien et la validation des bactéries mutantes bibliothèques existent.

La méthode exposée dans la présente publication décrit un ensemble de trois protocoles qui facilitent l’utilisation et l’entretien de l’ensemble de la PA14NR. Le premier protocole décrit la réplication de la bibliothèque comme recommandé aux bénéficiaires de l’ensemble de la PA14NR. Le deuxième protocole comprend des lignes directrices pour les rayures, de plus en plus et les stocker différents mutants identifiés à l’aide de la valeur de PA14NR. Le troisième protocole décrit les techniques de contrôle de la qualité, y compris amplification par PCR de fragments de mutants de transposons et séquençage subséquent pour confirmer l’identité de mutant. Cet ensemble de protocoles peut être également adapté pour la réplication et l’entretien des autres bactéries mutantes bibliothèques ou des collections. La reproduction des bactéries mutantes bibliothèques ou des collections est vivement conseillée pour préserver l’intégrité de le « original » (copie originale reçue). Réplication de plusieurs copies de l’ensemble des PA14NR de laboratoire de routine minimise la probabilité de contamination interwell de l’original.