Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2
Summary
Combinações de drogas sinérgica são difíceis e demorados identificar empiricamente. Aqui, descrevemos um método para identificar e validar sinérgicas pequenas moléculas.
Abstract
Embora antimicrobianos aumentaram drasticamente a expectativa de vida e qualidade de vida noséculo 20 , resistência aos antimicrobianos ameaça a capacidade da nossa sociedade inteira para tratar infecções sistêmicas. Nos Estados Unidos sozinho, infecções resistentes aos antibióticos matam cerca de 23.000 pessoas por ano e custo de cerca de USD 20 bilhões na área da saúde suplementar. Uma abordagem para combater a resistência antimicrobiana é a terapia de combinação, que é particularmente útil em fase crítica inicial da infecção, antes que o organismo infectante e seu perfil de resistência de droga foram identificados. Muitos tratamentos antimicrobianos usam terapias de combinação. No entanto, a maioria destas combinações são aditivo, significando que a eficácia combinada é igual a soma da eficácia individual aos antibióticos. Algumas terapias de combinação são sinérgicas: a eficácia combinada é muito maior do que o aditivo. Combinações sinérgicas são particularmente úteis porque eles podem inibir o crescimento de cepas resistentes aos medicamentos antimicrobianos. No entanto, estas combinações são raros e difíceis de identificar. Isto é devido o grande número de moléculas que precisava ser testado de forma emparelhada: uma biblioteca de 1.000 moléculas tem 1 milhão de combinações possível. Assim, os esforços foram feitos para prever as moléculas de sinergia. Este artigo descreve o nosso método de alta produtividade de previsão pares sinérgicos pequena molécula conhecidas como a sobreposição2 método (O2M). O2M usa padrões de conjuntos de dados químico-genética para identificar os mutantes que são hipersensíveis a cada molécula em um par sinérgica, mas não a outras moléculas. O laboratório marrom explora esta diferença de crescimento através da realização de uma tela de alta produtividade para moléculas que inibem o crescimento do mutante, mas não selvagem-tipo pilhas. O trabalho do laboratório anteriormente identificadas moléculas que sinergia com o antibiótico sulfametoxazol e o fluconazol antifúngico usando esta estratégia. Aqui, os autores apresentam um método para a tela para romance combinações sinérgicas, que pode ser alterada para vários microorganismos.
Introduction
Bactérias resistentes a antibióticos causam infecções mais de 2 milhões e 23.000 mortes anualmente nos Estados Unidos de acordo com o CDC1. Novos tratamentos são necessários para superar essas infecções. Estratégias para identificar esses novos tratamentos incluem o desenvolvimento de novas drogas antimicrobianas ou a redefinição de pequenas moléculas aprovadas para outras condições tratar infecções microbianas2,3,4. No entanto, a descoberta de novas drogas é muito dispendioso e demorado. Redefinição dos objetivos de drogas não pode identificar novos medicamentos ou drogas alvo5,6. Nosso laboratório centra-se em uma terceira estratégia conhecida como terapias de combinação sinérgica. Combinações sinérgicas ocorrem quando duas moléculas pequenas, juntos, têm uma eficácia maior do que o efeito aditivo de suas eficácias individuais7. Além disso, combinações sinérgicas podem ser eficazes contra um patógeno resistente a uma das pequenas moléculas do par, além de ter menos efeitos indesejados de fora do alvo, tornando-os grandes potenciais8,9, 10.
Pares sinérgicos são raras, ocorrendo em aproximadamente 4-10% das combinações de drogas11,12,13. Assim, técnicas tradicionais, tais como telas emparelhadas são desafiadores e demorado, com milhares de combinações possíveis de uma pequena biblioteca de 100 moléculas. Além disso, interações sinérgicas geralmente não podem ser previstas da atividade dos compostos14. No entanto, os autores desenvolveram uma abordagem de alto rendimento para triagem de pares sinérgicos, chamado a sobreposição2 método (O2M)12. Este método, descrito aqui, permite a identificação mais rápida e mais eficiente desses pares sinérgicos. O2M requer o uso de um par de sinérgico conhecido e um conjunto de dados de produto químico-genética. Química-genética conjuntos de dados são gerados quando uma biblioteca de mutantes nocaute é cultivada na presença de muitas moléculas pequenas diferentes. Se uma molécula em um par de sinérgica conhecido induz o mesmo fenótipo de um mutante de nocaute particular como a segunda molécula sinérgica, qualquer outra pequena molécula que provoca o fenótipo daquele mutante mesmo deve também sinergia com cada membro do conhecido par sinérgico. Esta lógica tem sido usada no laboratório marrom para identificar sinérgicas pares antibióticos ativos contra Escherichia coli (e. coli) e pares de drogas antifúngicas sinérgica ativos contra o fungo patogênico Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M não só é adaptável para diversos patógenos, mas permite a seleção de grandes bibliotecas de moléculas para identificar pares sinérgicos facilmente e rapidamente. Triagem com o mutante genético identificado por O2M nos permite validar apenas essas pequenas moléculas previstas para a sinergia. Assim, uma biblioteca de 2.000-molécula de teste pairwise levaria meses, Considerando que se havia apenas 20 moléculas nessa biblioteca prevista a sinergia, testes de sinergia agora leva uma questão de dias. O2M não requer conhecimentos de programação, e o equipamento necessário está disponível na maioria dos laboratórios ou instalações do núcleo. Além de pesquisadores interessados em combinações de drogas, análise O2M é de interesse para alguém que concluiu um teste de drogas e quer expandir seus sucessos identificando interações medicamentosas importantes. Abaixo está o protocolo para identificação de moléculas pequenas sinérgicas em bactérias, bem como validando as interações sinérgicas previstas em conhecidos ensaios15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pares sinérgicos pequena molécula podem ser uma ferramenta poderosa no tratamento de infecções microbianas, ainda não chegaram a seu potencial clínico completo porque pares sinérgicos são difíceis de identificar. Este artigo descreve um método para identificar pares sinérgicos muito mais rápidos do que a simples combinações emparelhadas. Usando conjuntos de dados químico-genética, O2M identifica mutantes com nocautes de gene que podem ser usados como uma leitura de grandes bibliotecas de tela de pequenas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma concessão de inicialização do departamento de patologia, Universidade de Utah para J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
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