Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición2
Summary
Combinaciones de fármacos sinérgicos son difíciles y lleva mucho tiempo identificar empíricamente. Aquí, describimos un método para identificar y validar sinérgicas pequeñas moléculas.
Abstract
Aunque los medicamentos antimicrobianos han aumentado dramáticamente la vida útil y calidad de vida enel siglo 20 , resistencia a los antimicrobianos amenaza la capacidad de nuestra sociedad entera para el tratamiento de infecciones sistémicas. En los Estados Unidos, las infecciones resistentes a los antibióticos mata a aproximadamente 23.000 personas al año y costo alrededor de 20 billones dólares en atención médica adicional. Un método para combatir la resistencia a los antimicrobianos es la terapia de combinación, que es particularmente útil en la etapa crítica temprana de la infección, antes de que el organismo infectante y su perfil de resistencia a drogas han sido identificados. Muchos tratamientos antimicrobianos utilizan terapias combinadas. Sin embargo, la mayoría de estas combinaciones son aditivos, lo que significa que la eficacia combinada es igual a la suma de la eficacia de antibióticos individual. Algunas terapias de combinación son sinérgicos: la eficacia combinada es mucho mayor que el añadido. Combinaciones sinérgicas son particularmente útiles, ya que pueden inhibir el crecimiento de cepas resistentes a los fármacos antimicrobianos. Sin embargo, estas combinaciones son raros y difíciles de identificar. Esto es debido al número de moléculas necesarias para ser probado en forma pares: una biblioteca de 1.000 moléculas tiene 1 millón de combinaciones posibles. Así, se ha intentado predecir moléculas para la sinergia. Este artículo describe el método de alto rendimiento para predecir pares sinérgicos pequeña molécula conocidas como la superposición2 método (O2M). O2M utiliza patrones de conjuntos de datos químicos genéticos para identificar a mutantes que son hipersensibles a cada molécula en un par sinérgico pero no a otras moléculas. El laboratorio marrón aprovecha esta diferencia de crecimiento realizando una pantalla de alto rendimiento para las moléculas que inhiben el crecimiento de la mutante pero las células no-tipo salvaje. Trabajo de laboratorio previamente identificado moléculas que sinergice con el antibiótico trimethoprim y lo antimicóticos fluconazol utilizando esta estrategia. Aquí, los autores presentan un método para pantalla para novela combinaciones sinérgicas, que puede ser alterado por múltiples microorganismos.
Introduction
Las bacterias resistentes a los antibióticos causan infecciones más de 2 millones y 23.000 muertes anualmente en los Estados Unidos según la CDC1. Nuevos tratamientos se necesitan para superar estas infecciones. Estrategias para identificar estos nuevos tratamientos incluyen el desarrollo de nuevos antimicrobianos o la reasignación de pequeñas moléculas aprobadas para que otras condiciones para el tratamiento de las infecciones microbianas2,3,4. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos medicamentos es muy costoso y desperdiciador de tiempo. Reasignación de drogas no puede identificar nuevos fármacos o drogas objetivos5,6. Nuestro laboratorio se centra en una tercer estrategia conocida como terapias de combinación sinérgica. Combinaciones sinérgicas se producen cuando dos moléculas pequeñas juntas tienen una eficacia mayor que el efecto aditivo de sus eficacias individuales7. Además, combinaciones sinérgicas pueden ser efectivos contra un patógeno resistente a una de las moléculas pequeñas en la pareja además de tener menos efectos no deseados de fuera de objetivo, hacerlas gran potencial8,9, 10.
Pares sinérgicos son raras, ocurriendo en aproximadamente 4-10% de combinaciones de drogas11,12,13. Así, las técnicas tradicionales tales como pantallas pares son difícil y desperdiciador de tiempo, con miles de combinaciones posibles de una pequeña biblioteca de cien moléculas. Por otra parte, las interacciones sinérgicas usualmente no se puede predecir de la actividad de los compuestos14. Sin embargo, los autores desarrollaron un enfoque de alto rendimiento para detectar pares sinérgicos, llamado el traslapo2 método (O2M)12. Este método, descrito aquí, permite la identificación más rápido, más eficiente de estos pares sinérgicos. O2M requiere el uso de un par sinérgico conocido y un conjunto de datos de química genética. Conjuntos de datos de química genética se generan cuando una biblioteca de mutantes knockout se cultiva en presencia de muchas moléculas pequeñas diferentes. Si una molécula en un par sinérgico conocido induce el mismo fenotipo de un mutante de nocaut en particular como la segunda molécula sinérgica, cualquier molécula pequeña que provoca el fenotipo de ese mismo mutante debe también sinergizar con cada miembro de la conocida par sinérgico. Este razonamiento se ha utilizado en el laboratorio de marrón para identificar pares antibióticos sinérgicos activas contra Escherichia coli (e. coli) y antimicóticos sinérgico activo contra el hongo Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M no sólo es adaptable para diversos agentes patógenos, pero permite la proyección de grandes bibliotecas de moléculas para identificar pares sinérgicos fácilmente y rápidamente. Proyección con el mutante genético identificado por O2M nos permite validar sólo aquellas moléculas pequeñas para sinergia. Así pues, prueba una biblioteca de 2.000 moléculas pairwise llevaría meses, mientras que si sólo había 20 moléculas en eso Biblioteca predicho para sinergizar, pruebas de sinergia ahora lleva unos días. O2M no requiere conocimientos de programación, y el equipo necesario está disponible en la mayoría de laboratorios o instalaciones de la base. Además de los investigadores interesados en combinaciones de medicamentos, análisis de O2M es de interés para cualquier persona que ha completado una pantalla de la droga y quiere ampliar sus éxitos mediante la identificación de las interacciones de fármacos importantes. A continuación es el protocolo para identificar moléculas pequeñas sinérgicas en las bacterias, así como validar las interacciones sinérgicas predichas en ensayos bien conocido15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pares sinérgicos molécula pequeña pueden ser una poderosa herramienta en el tratamiento de las infecciones microbianas, pero no han alcanzado su potencial clínica completa porque pares sinérgicos son difíciles de identificar. Este artículo describe un método para identificar pares sinérgicos mucho más rápidos que las combinaciones pares simple. Mediante el uso de conjuntos de datos de genética química, O2M identifica a mutantes con knockouts de genes que luego pueden ser utilizados como una lectura a las bib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención de puesta en marcha desde el Departamento de patología, Universidad de Utah para J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
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